Un guide de référence pour la préparation des solutions de laboratoire
Reconstituer des peptides lyophilisés : préparer une solution mère de laboratoire.
Au laboratoire, un peptide lyophilisé est préparé en solution mère avant d’entrer dans un essai, un étalonnage ou une méthode analytique. Ce guide décrit la reconstitution de la poudre sèche en solution mère de laboratoire, du flacon scellé jusqu’à une solution limpide, étiquetée et de concentration connue. Il suit la méthode dans l’ordre, du début à la fin, et renvoie aux guides spécialisés sur les solvants, le pH, les problèmes et la conservation.
Pour la recherche en laboratoire seulement. Non destiné à un usage humain ou vétérinaire.
Dans ce guide
Qu’est-ce qu’une solution mère, et pourquoi est-elle concentrée?
Une solution mère est préparée plus concentrée que ce dont l’essai a besoin, puis diluée dans le tampon de l’essai.
Au laboratoire, la reconstitution produit une solution mère, habituellement de 10 à 1000 fois plus concentrée que la solution de travail. Un article de consensus sur les étalons peptidiques en spectrométrie de masse donne cette plage, et les raisons en sont pratiques.
Une solution mère concentrée a trois avantages :
- Elle réduit la part du premier solvant. Seul un petit volume de solution mère entre dans l’essai, si bien que l’acide ou le solvant organique qui a servi à dissoudre le peptide pèse peu dans le mélange final.
- Elle limite les pertes sur le contenant. Une solution concentrée perd une plus petite part de son peptide sur les parois du tube qu’une solution diluée.
- Elle permet de préparer les solutions de travail au besoin. Elles sont diluées à partir de la solution mère le plus près possible du moment où la méthode en a besoin, plutôt que préparées longtemps d’avance.
Les solutions diluées sont aussi les moins stables. Les instructions de manipulation de Thermo Fisher décrivent les solutions de peptides comme instables, d’autant plus que leur concentration est faible. Cette mise en garde vise les solutions de peptides en général; elle ne décrit aucun matériel GPC.
Que vérifier avant d’ouvrir le flacon?
La reconstitution pour une méthode analytique commence avant l’ouverture du flacon, avec le certificat, la séquence et les limites de solvant de la méthode. Un solvant convenable remplit trois conditions : il dissout le peptide, il convient à l’expérience, et il ne réagit pas avec le peptide ni ne le dégrade.
De quelle quantité partez-vous?
- À lire : le certificat du lot, et ce qu’il indique sur la quantité : un contenu net mesuré, une teneur nette en peptide, ou seulement la quantité étiquetée.
- Pourquoi c’est important : la teneur nette en peptide est la part d’une poudre pesée qui est du peptide, habituellement mesurée par analyse des acides aminés; elle exclut l’eau et les contre-ions. La quantité étiquetée, un contenu mesuré et une masse brute corrigée donnent chacun une concentration différente pour le même volume de solvant.
- À surveiller : l’humidité. L’eau absorbée de l’air abaisse la teneur en peptide d’une portion pesée, raison de plus pour garder le flacon scellé jusqu’à ce qu’il soit tempéré.
Quel solvant a des chances de fonctionner?
- À lire : la séquence d’acides aminés, avant qu’un solvant touche la poudre. Ses résidus chargés sont le premier indice de la capacité de l’eau à la dissoudre.
- Pourquoi c’est important : certains fournisseurs indiquent un solvant propre au lot sur leur certificat. GPC ne publie aucun solvant suggéré ni aucune valeur de solubilité pour ses composés; ce sont donc la séquence et votre méthode qui décident.
- Étape suivante : le guide sur la charge et le pH montre comment compter les charges, et le guide sur les solvants traduit ce décompte en premier solvant.
Que peut tolérer l’essai?
- À lire : les limites de votre méthode pour l’acide, la base et le solvant organique.
- Pourquoi c’est important : la concentration maximale utilisable d’un premier solvant dépend de la tolérance de l’essai à ce solvant; la méthode restreint donc le choix avant même le peptide.
- À prévoir : la dilution. La concentration de travail et le facteur de concentration de la solution mère indiquent ensemble quelle part du premier solvant atteindra l’essai.
Si vous envisagez de faire analyser un flacon, mettez-le de côté avant de commencer. Une solution que vous préparez n’est pas un échantillon accepté par le Programme de vérification GPC : le programme exige le flacon scellé d’origine, avec son étiquette intacte, jamais ouvert, réétiqueté ni transféré.
Comment préparer une solution mère de peptide, étape par étape?
Les étapes ci-dessous servent à préparer une solution mère; dans ce guide, la reconstitution désigne toujours cette préparation pour une méthode de laboratoire. Chaque étape s’appuie sur des documents de manipulation de fournisseurs ou sur des articles de méthodes, et aucun ne propose de recette unique : la séquence et la méthode choisissent le solvant.
- 01
Laisser le flacon scellé se tempérer
Laissez le flacon scellé atteindre la température ambiante avant de l’ouvrir, de préférence dans un dessiccateur, pour que la poudre absorbe moins d’humidité de l’air. Les sources n’indiquent aucune durée; ce guide n’en donne donc pas. Si vous pesez une portion, travaillez vite et refermez bien le contenant.
- 02
Ramener la poudre au fond
Centrifugez brièvement le flacon, ou tapotez-le, pour que toute la poudre soit au fond avant d’ajouter le moindre solvant.
- 03
Faire un essai de solubilité sur une petite portion
Essayez le premier solvant sur une petite portion avant d’engager toute la quantité. Choisissez un premier solvant que la lyophilisation peut éliminer, comme l’eau, l’acide acétique dilué ou le bicarbonate d’ammonium : en cas d’échec, la portion peut être lyophilisée et un autre solvant essayé sur le même matériel. Lorsque la quantité est trop petite pour être divisée, le guide sur les peptides lyophilisés traite de la dissolution du flacon entier.
- 04
Choisir le premier solvant
Partez de l’eau, ou du premier solvant que suggère le décompte des charges de la séquence, dans les limites de la méthode. Si le premier solvant n’est pas l’eau, dissolvez-y complètement le peptide avant d’ajouter de l’eau ou un tampon : les peptides se dissolvent généralement plus vite dans un acide ou un solvant organique seul que dans un mélange avec l’eau.
- 05
Ajouter le solvant lentement
Ajoutez le solvant lentement, sans éclaboussures ni bulles, pour qu’il mouille la poudre. Les éclaboussures et les bulles créent des surfaces air-liquide, et l’étape suivante explique pourquoi elles comptent.
- 06
Mélanger par rotation par défaut et éviter la mousse
Faites tourner doucement le contenant et laissez du temps à la poudre : la dissolution d’un peptide prend parfois plusieurs heures. C’est la mousse qu’il faut éviter. Les travaux sur les protéines montrent que le cisaillement dans le liquide a peu de chances, à lui seul, d’endommager la plupart d’entre elles, alors que les interfaces air-liquide en mouvement peuvent être très dommageables, et une agitation vigoureuse peut faire mousser. Un passage bref et doux au vortex, sans mousse, est compatible avec toutes les sources.
- 07
Au besoin, ultrasons brefs ou léger réchauffement
S’il reste des particules, quelques minutes dans un bain à ultrasons peuvent aider à les défaire, pourvu que l’échantillon ne se réchauffe pas trop. Un réchauffement prudent aide aussi, sans dépasser 40 °C. Gardez les ultrasons courts et en bain : on a montré que les ultrasons provoquent l’agrégation de diverses protéines.
- 08
Vérifier que la solution est limpide
Une solution de peptide bien dissous est parfaitement limpide, sans particules ni trouble. Si elle a gélifié, paraît trouble ou montre des particules après les ultrasons, le peptide est en suspension et non dissous, et il faut un solvant plus fort. La diffusion de la lumière, ou l’absorbance d’une série de dilutions mesurée avec et sans centrifugation, le confirme. Centrifugez la solution avant qu’elle entre dans une méthode, pour que tout résidu reste dans le tube.
- 09
Ensuite seulement, diluer dans le tampon
Ajoutez les sels du tampon une fois le peptide dissous, pas avant : les sels nuisent à la solubilité, et un peptide qui ne se dissout pas dans un tampon peut être difficile à récupérer. Versez la solution concentrée goutte à goutte dans le tampon, sous agitation douce et constante, pour que le peptide ne rencontre jamais le tampon à forte concentration locale et qu’un trouble se voie dès qu’il apparaît.
Notez au fur et à mesure le solvant, les volumes, les durées et tout passage aux ultrasons ou réchauffement. La fiche de préparation, plus bas, indique quoi conserver.
Sur quoi les sources divergent-elles?
Les documents des fournisseurs ne disent pas tous la même chose. Trois divergences comptent à la paillasse, et chacune se résout dès qu’on regarde ce que la source cherchait à éviter.
Rotation ou vortex
Ce que disent les sources
R&D Systems, à propos des protéines, recommande une agitation douce et prévient qu’une agitation vigoureuse peut faire mousser. L’organigramme de solubilité des peptides de JPT prévoit le vortex ou les ultrasons après chaque étape, et LifeTein passe doucement au vortex pendant la dissolution dans le DMSO.
Comment ce guide les lit
La préoccupation commune est la mousse. Mélangez par rotation par défaut. Un passage bref et doux au vortex, sans mousse, est compatible avec toutes les sources.
L’eau d’abord, ou le tampon directement
Ce que disent les sources
Hoofnagle et ses collègues déconseillent de dissoudre dans le PBS parce que les sels nuisent à la solubilité, et Sigma-Aldrich prévient qu’un matériel qui ne se dissout pas dans le tampon d’essai peut être difficile à récupérer. Bachem recommande le PBS à pH 7,0–7,4 lorsqu’une concentration de 1 mg/mL ou moins suffit. Les instructions de Thermo Fisher admettent l’eau stérile ou un tampon.
Comment ce guide les lit
Les positions s’accordent une fois la concentration prise en compte. Dissolvez dans l’eau ou dans un premier solvant volatil, puis ajoutez le tampon. Pour les solutions diluées, à 1 mg/mL ou moins, certains fournisseurs dissolvent directement dans le PBS.
Combien de temps attendre
Ce que disent les sources
Une méthode de R&D Systems pour les protéines prévoit 15 à 30 minutes à température ambiante sous agitation douce. Bachem signale que la dissolution d’un peptide prend parfois jusqu’à plusieurs heures.
Comment ce guide les lit
Le temps est une étape à part entière. Laissez du temps à la solution avant de passer aux ultrasons, au réchauffement ou à un solvant plus fort, et jugez-la à sa limpidité plutôt qu’à la montre.
Les fournisseurs fixent aussi des limites différentes pour le solvant organique dans les essais cellulaires. Le guide sur les solvants les compare.
Qu’est-ce qui change quand on ajoute du solvant?
La concentration change; la quantité de peptide, elle, ne change pas.
La concentration est la quantité divisée par le volume de solution. Une goutte d’encre dans un bécher et la même goutte dans un seau : l’encre est la même, seule sa concentration diffère. Quarante billes réparties dans un petit plateau ou dans un grand restent quarante billes.
La figure amène le même 1,000 mg de peptide à trois volumes finaux. La quantité est fixe dans chaque panneau. Seule la concentration change, d’un facteur dix chaque fois, et à une masse moléculaire illustrative de 1000,0 g/mol, la concentration molaire suit.
La même règle régit la dilution. La concentration multipliée par le volume donne la quantité; la quantité transférée d’une solution mère est donc celle qu’on retrouve dans la solution de travail préparée à partir d’elle : C1V1 = C2V2.
La poudre dissoute ajoute très peu de volume, environ 0,7 µL par milligramme selon l’estimation habituelle pour les protéines; pour la plupart des solutions mères, le volume de solvant ajouté est donc pratiquement le volume final.
- 100 µL10,00 mg/mL
- 1 mL1,000 mg/mL
- 10 mL0,1000 mg/mL
- Volume final 100,0 µL
- 10,00 mg/mL, soit 10,00 mM à 1000,0 g/mol
- Volume final 1,000 mL
- 1,000 mg/mL, soit 1,000 mM
- Volume final 10,00 mL
- 0,1000 mg/mL, soit 100,0 µM
Valeurs illustratives, et non une mesure GPC. La masse moléculaire est choisie pour que le passage des mg/mL aux mM soit facile à suivre, et elle ne correspond à aucun composé GPC.
Que signifie travailler de façon aseptique pour une solution mère?
Au sens du laboratoire, le travail aseptique empêche les enzymes et les microbes d’entrer dans la solution mère. Il ne rend pas la solution stérile, et il ne la rend pas stable.
Trois habitudes font l’essentiel du travail :
- Porter des gants. Les mains transportent des enzymes et des bactéries, et les unes comme les autres peuvent contaminer une solution de peptide.
- Partir de produits stériles. Utilisez de l’eau stérile ou un acide dilué stérile, des contenants stériles et des surfaces propres.
- Laisser le solvant aider. L’acide ou le solvant organique d’une solution mère ralentit aussi la croissance microbienne.
Un filtre de 0,2 µm retire les bactéries qui auraient pu entrer dans la solution. Les filtres sont cotés selon leur capacité à retenir une petite bactérie d’épreuve, d’environ 0,3 µm, et les cotes de 0,2 µm et de 0,22 µm sont considérées comme équivalentes. Un filtre peut aussi comporter quelques pores plus grands que sa taille nominale.
La filtration ne retire pas les endotoxines, et une filtration à la paillasse ne prouve pas la stérilité. Dans le guide de la FDA sur la fabrication aseptique, un filtrat stérile repose sur un filtre validé par des épreuves microbiennes et vérifié par des essais d’intégrité. Sans ce dossier, écrivez « filtré sur 0,2 µm » dans le cahier, et non « stérile ».
La stérilité ne dit rien non plus de la chimie. Bachem signale que les peptides en solution peuvent se dégrader lentement, même lorsque la solution est stérile et exempte d’oxygène. Le choix de la membrane, et le moment de filtrer, sont traités dans le guide sur la conservation.
Que mettre sur le tube, et que consigner dans le cahier?
Consignez chaque reconstitution dans le cahier de laboratoire, avec la concentration, le solvant, la base de quantité et la date de la solution mère. L’étiquette du tube en porte la version courte.
L’étiquette du tube indique :
- le nom de la solution, selon votre propre désignation;
- la concentration, en mg/mL ou en mM;
- le solvant, selon sa composition finale;
- le numéro du lot d’origine;
- la date de préparation et les initiales de la personne qui l’a préparée;
- une date de réévaluation ou d’élimination, fixée par votre laboratoire.
Ces champs suivent les bonnes pratiques de l’OMS pour les laboratoires de contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques, qui demandent que l’étiquette d’une solution préparée au laboratoire indique son nom, sa date de préparation et les initiales de l’analyste, une date de réévaluation ou d’élimination justifiée, et sa concentration. La date de réévaluation relève de votre laboratoire. Ce guide n’en fixe aucune, et aucune valeur GPC n’en suggère une.
Le cahier contient le reste : la base de quantité et la quantité, la masse moléculaire et le fait qu’elle vise ou non le peptide libre, le volume final et le calcul, le premier solvant et chaque étape, la vérification de la limpidité, toute filtration et sa membrane, les tubes et le volume des aliquotes, la température de conservation, et tout écart. Le même texte de l’OMS demande de consigner la préparation des solutions volumétriques, et cette habitude sert tout autant une solution mère de peptide.
Le calculateur produit une fiche de préparation avec la date, le lot, la base, le solvant, le volume et les concentrations, ainsi qu’un espace pour les initiales, prête à copier dans un cahier ou à imprimer.
- Champs de l’étiquette viergeContenu; concentration; solvant final; lot d’origine; date; initiales; date de réanalyse ou de rejet.
- OMS, TRS 957, annexe 1, § 10.5
- Bonnes pratiques de l’OMS pour les laboratoires de contrôle de la qualité (en anglais)
Où le travail se poursuit-il?
Une solution mère limpide et étiquetée est le point de départ de la méthode. Deux guides prennent le relais.
Garder la solution mère
Les solutions changent plus vite que la poudre sèche. Bachem recommande de répartir une solution de peptide en aliquotes et de les garder congelées sous −15 °C. Le guide sur la conservation traite de la taille des aliquotes, du choix des tubes, de la congélation et de la décongélation, de l’adsorption sur les surfaces et des filtres.
Quand la solution n’est pas limpide
Un trouble, des particules, un gel, de la mousse ou un précipité à la dilution renvoient chacun à une cause différente. Le guide de dépannage part de ce que vous observez pour aller vers ce qu’il faut essayer, et jusqu’au moment où il vaut mieux récupérer le matériel ou recommencer.
Questions fréquentes sur la préparation d’une solution mère de peptide.
Comment reconstituer un peptide lyophilisé en solution mère de laboratoire?
Il n’existe pas de recette universelle : la séquence et la méthode choisissent le solvant. Laissez le flacon scellé atteindre la température ambiante dans un dessiccateur, ramenez la poudre au fond et faites un essai sur une petite portion dans l’eau ou dans le premier solvant que suggère le décompte des charges. Dissolvez-la complètement dans ce solvant en mélangeant doucement, sans mousse, avec au besoin quelques minutes de bain à ultrasons ou un réchauffement d’au plus 40 °C. Vérifiez que la solution est limpide, puis diluez dans le tampon jusqu’à la concentration voulue pour la solution mère.
Comment faire un essai de solubilité sur une petite portion?
Pesez une petite portion et essayez-y le premier solvant avant d’engager toute la quantité. Choisissez un premier solvant que la lyophilisation peut éliminer, comme l’eau, l’acide acétique dilué ou le bicarbonate d’ammonium, pour qu’une portion qui ne se dissout pas puisse être séchée et essayée de nouveau. Passez brièvement aux ultrasons avant de conclure à l’échec du solvant : un gel, un trouble ou des particules visibles signifient que le peptide est en suspension, et non dissous. Lorsque la quantité est trop petite pour être divisée, le guide sur les peptides lyophilisés traite de la dissolution du flacon entier.
Comment confirmer qu’un peptide est entièrement dissous?
Une solution de peptide bien dissous est parfaitement limpide, sans particules ni trouble. Deux vérifications de laboratoire vont plus loin : la diffusion de la lumière, ou l’absorbance d’une série de dilutions mesurée avec et sans centrifugation. Si l’absorbance baisse une fois l’échantillon centrifugé, une partie du matériel était en suspension plutôt que dissoute.
Quel volume donne une solution mère à 1 mg/mL ou à 1 mM?
Le volume est la quantité divisée par la concentration visée. À 1,000 mg/mL, le volume en millilitres est égal à la quantité de peptide en milligrammes : 2,000 mg demandent donc 2,000 mL. À 1,000 mM, divisez d’abord par la masse moléculaire : 2,000 mg à une masse illustrative de 1250,0 g/mol font 1,600 µmol, qui demandent 1,600 mL. Notez la quantité de départ utilisée, qu’il s’agisse de la quantité étiquetée, d’un contenu mesuré sur un certificat ou de la masse brute × la teneur nette × l’aire HPLC, car chacune donne un volume différent.
Faut-il mélanger une solution de peptide par rotation ou au vortex?
Mélangez par rotation par défaut et évitez la mousse. Les travaux sur les protéines désignent les interfaces air-liquide en mouvement, plutôt que le cisaillement dans le liquide, comme principale cause de dommages, et une agitation vigoureuse peut faire mousser. Les fournisseurs de peptides utilisent pourtant le vortex, et un passage bref et doux au vortex, sans mousse, est compatible avec toutes les sources.
Comment travailler de façon aseptique en préparant une solution mère?
Au sens du laboratoire, le travail aseptique repose sur des gants, des surfaces propres, et des solvants et contenants stériles, qui empêchent les enzymes et les microbes d’entrer dans la solution mère. Un filtre de 0,2 µm retire ensuite les bactéries, mais il ne retire pas les endotoxines, et une filtration à la paillasse sans filtre validé et soumis à un essai d’intégrité ne prouve pas que la solution est stérile. Consignez l’étape comme « filtré sur 0,2 µm », et rappelez-vous qu’une solution stérile peut quand même changer chimiquement.
Une solution que j’ai préparée peut-elle être analysée dans le cadre du Programme de vérification GPC?
Non. Le programme exige le flacon scellé d’origine avec son étiquette intacte, et le matériel ne doit être ni ouvert, ni réétiqueté, ni transféré. Si vous pensez faire analyser un flacon, mettez-le de côté, fermé, avant de préparer une solution. Le guide sur l’analyse d’un flacon au Canada explique la démarche.