Un guide de référence pour la préparation des solutions
Choisir un solvant de reconstitution pour les peptides.
Le solvant de reconstitution d’une solution mère de laboratoire se choisit d’après deux éléments : la séquence du peptide et la méthode qui utilisera la solution. Ce guide part de l’eau, se sert des charges de la séquence pour choisir un premier solvant acide, basique ou organique, et explique comment les sels, les co-solvants et le choix de l’acide pèsent sur un essai ou sur une analyse HPLC ou LC-MS.
Pour la recherche en laboratoire seulement. Non destiné à un usage humain ou vétérinaire.
Dans ce guide
Pourquoi commencer par l’eau, et quelle qualité choisir?
L’eau est le premier solvant à essayer. Un acide, une base ou un solvant organique n’intervient que si l’eau seule ne dissout pas le peptide.
Le guide de solubilité de GenScript essaie d’abord l’eau. Hoofnagle et coll., qui traitent des étalons peptidiques pour la spectrométrie de masse, dissolvent eux aussi d’abord dans l’eau, ajustent le pH d’après la séquence et n’ajoutent un peu de solvant organique que pour aider la dissolution. Les peptides de moins d’environ six résidus se dissolvent généralement dans l’eau seule.
La qualité de l’eau compte autant que la décision de commencer par elle. Choisissez-la en fonction de la méthode qui utilisera la solution.
- Eau ultrapure (type I)
- Résistivité de 18,2 MΩ·cm et carbone organique total inférieur à environ 10 µg/L. C’est la qualité employée pour la HPLC, la culture cellulaire et tissulaire et l’ICP-MS.
- Eau de qualité HPLC
- Vendue en bouteille pour les phases mobiles, filtrée sur membrane de 0,2 µm, avec au plus 1 mg/L de résidu après évaporation.
- Normes
- Les normes ASTM D1193 et ISO 3696 définissent les qualités d’eau de laboratoire.
Ni la définition de l’eau de type I ni la spécification de l’eau de qualité HPLC n’indiquent que l’eau est stérile. Pour le travail sur cellules, utilisez une eau vendue stérile, ou filtrez-la : Sigma-Aldrich nomme l’eau distillée stérile, ou l’acide acétique stérile à 0,1 % s’il y a lieu, pour les solutions mères. Le guide principal de la série traite de la filtration et de ce que « stérile » permet ou non d’établir.
Comment la charge d’un peptide oriente-t-elle le choix du premier solvant de reconstitution?
Pour une méthode analytique ou un essai, le premier solvant de reconstitution découle du comptage des charges de la séquence.
La règle courante attribue à chaque groupe la valeur suivante :
- Groupes basiques : +1 pour chaque lysine (K) et arginine (R), et +1 pour une amine N-terminale libre.
- Groupes acides : −1 pour chaque acide aspartique (D) et acide glutamique (E), et −1 pour un carboxyle C-terminal libre.
- Histidine (H) : les sources divergent. Sigma-Aldrich compte +1 seulement sous pH 6 et 0 au-dessus; JPT et GenScript comptent +1 à tout pH.
Les extrémités comptent. Le guide de Bachem demande de tenir compte des groupes N- et C-terminaux, et une extrémité N-terminale acétylée ou C-terminale amidée ne porte pas de charge terminale. Lisez les groupes terminaux sur le certificat avant de compter.
Une somme positive désigne un peptide basique, une somme négative un peptide acide, et une somme nulle un peptide neutre. Après l’eau, chaque classe a son premier solvant habituel : l’acide acétique dilué pour un peptide basique, le bicarbonate d’ammonium ou l’ammoniaque dilués pour un peptide acide, et un petit volume de solvant organique pour un peptide neutre ou très hydrophobe.
Sigma-Aldrich tient aussi compte de la proportion de résidus chargés. Lorsque moins de 10 % des résidus sont chargés, ou que plus de 50 % sont hydrophobes, elle passe directement à un solvant organique comme l’acétonitrile, le DMSO ou le DMF.
Les peptides portent en général plus de charges entre pH 6 et 8 qu’entre pH 2 et 6; c’est pourquoi beaucoup se dissolvent mieux près de la neutralité. Les séquences très hydrophobes et celles qui ont tendance à s’agréger font exception. Bachem ajoute que les sels de trifluoroacétate riches en arginine et en lysine tendent à se dissoudre à pH neutre.
La règle est un point de départ, pas une prédiction. Le choix d’un solvant peut demander plusieurs tentatives : confirmez-le par un essai de solubilité sur une petite portion avant de dissoudre tout l’échantillon.
- D’abord, les limites de la méthodePour les essais cellulaires, vérifiez la limite de DMSO ≤ 1 %; pour la CL-SM, évitez les sels non volatils. Essayez une petite portion.
- Lire la séquence et le certificatVérifiez la forme saline et les extrémités; essayez une petite portion.
- Séquence courtePour moins d’environ six résidus, essayez l’eau de type I.
- Compter les chargesComptez les extrémités libres, K, R, D et E; His est positif sous pH 6.
- Charge positiveEssayez l’eau, puis un petit volume d’acide acétique à 10–30 % au besoin.
- Charge négativeVérifiez la cystéine libre. Sinon, essayez l’eau puis une base diluée; gardez le pH sous 8.
- Cystéine libreÉvitez l’ammoniaque et le bicarbonate; utilisez un solvant dégazé légèrement acide ou du DMF.
- Neutre ou hydrophobeUtilisez le plus petit volume d’acétonitrile, de DMSO ou de DMF, puis ajoutez-le à l’eau ou au tampon.
- Charge négative sans cystéine libreEssayez l’eau, puis un petit volume de bicarbonate d’ammonium 0,1 M ou d’ammoniaque diluée; vérifiez un pH près de 7 et restez sous 8.
- Bain et contrôle de limpiditéUtilisez brièvement le bain à ultrasons; chauffez au besoin sans dépasser 40 °C. Gel, trouble ou particules indiquent du matériel en suspension.
- Si la solution reste troubleSi le premier solvant peut être éliminé, lyophilisez la portion d’essai et essayez-en un autre. Sinon, arrêtez et consignez chaque solvant essayé.
- Une fois dissousDiluez dans le tampon en ajoutant les sels en dernier; consignez la composition finale du solvant.
Quand l’acide acétique dilué est-il le bon premier solvant?
Lorsque le comptage des charges est positif et que l’eau seule n’a pas dissous le peptide, les fournisseurs ajoutent un petit volume d’acide acétique, puis diluent à l’eau jusqu’à la concentration dont la méthode a besoin.
L’acide acétique est volatil. Une portion d’essai qui ne se dissout pas peut être séchée par lyophilisation et essayée dans le solvant suivant; c’est pourquoi Sigma-Aldrich conseille un premier solvant que la lyophilisation peut éliminer.
Pour une solution mère courante, Sigma-Aldrich emploie un acide beaucoup plus faible, l’acide acétique à 0,1 %. Sa méthode pour des séries de peptides ne porte l’acide à 10 % (v/v) que pour les peptides qui restent non dissous.
Le chiffre de 0,6 % d’acide acétique circule sur des sites de vendeurs, mais aucun des documents de fournisseurs ou des articles révisés par des pairs consultés pour ce guide ne le donne.
Les guides des fournisseurs s’entendent sur la démarche et diffèrent sur la concentration. Les valeurs ci-dessous sont celles de chaque source.
Pour donner un ordre de grandeur, selon notre calcul à partir de la masse volumique et de la masse molaire de l’acide acétique : 25 % (v/v) correspond à environ 4,4 M, 10 à 30 % à environ 1,7 à 5,2 M, et 0,1 % à environ 17 mM.
Quelle base pour un peptide acide, et que faire de la cystéine?
Pour un peptide acide que l’eau n’a pas dissous, les fournisseurs ajoutent un petit volume d’une base volatile, diluent à l’eau et vérifient le pH.
Les concentrations qu’ils indiquent :
- Sigma-Aldrich : bicarbonate d’ammonium 0,1 M, puis eau, en s’assurant que le pH final est d’environ 7 et en l’ajustant par petites étapes au besoin.
- Bachem : ammoniaque aqueuse à 0,1 %.
- GenScript : un petit volume d’hydroxyde d’ammonium.
- AAPPTec : bicarbonate d’ammonium à 10 %.
- Hoofnagle et coll. : bicarbonate d’ammonium à 1 %, ou hydroxyde d’ammonium.
Une cystéine libre change le choix. Son thiol s’oxyde rapidement en disulfure au-dessus de pH 7 : Bachem dissout donc ces peptides dans un solvant acide soigneusement dégazé, et GenScript exclut pour eux l’hydroxyde d’ammonium et les autres solutions basiques.
Sigma-Aldrich précise que l’oxydation de la cystéine s’accélère à mesure que le pH monte : évitez un pH supérieur à 8, et refroidissez la solution si un pH plus élevé est inévitable. Thermo Fisher ne relève le pH qu’avec des bases très faibles, car une base forte peut racémiser un peptide.
Les peptides qui contiennent de la cystéine, de la méthionine ou du tryptophane demandent aussi des solvants exempts d’oxygène, et GenScript purge ses tampons d’essai à l’argon ou à l’azote. Un agent réducteur comme le DTT protège un thiol libre, mais le DTT et le TCEP ouvrent aussi les ponts disulfure : omettez-les lorsqu’un pont disulfure fait partie de la structure du peptide.
Comment employer le DMSO, le DMF et l’acétonitrile comme co-solvants?
Un peptide neutre ou très hydrophobe commence dans un petit volume de solvant organique. La règle : en employer juste assez pour dissoudre le peptide, puis diluer.
Dissoudre complètement, puis diluer lentement
Dissolvez complètement le peptide dans le plus petit volume pratique d’acétonitrile, de DMSO ou de DMF; Thermo Fisher emploie un mélange de DMSO et d’eau à 50 % (v/v). Ajoutez ensuite la solution organique goutte à goutte au tampon aqueux, en agitant doucement et sans arrêt. Si le DMSO interfère avec l’expérience, le DMF ou l’acétonitrile peuvent le remplacer. Si le peptide ressort de la solution, Thermo Fisher le sèche de nouveau et recommence avec un peu plus de DMSO à 50 %.
Le DMSO et le DMF ne s’éliminent pas au séchage
L’eau, l’acide acétique et l’acétonitrile s’éliminent par lyophilisation; le DMSO et le DMF, non. N’y engagez un échantillon que si la méthode les tolère. Hoofnagle et coll. signalent aussi que des peptides conservés dans le DMSO pur peuvent précipiter lorsqu’on les ajoute à une solution aqueuse, et que les solutions dans le DMSO doivent être diluées avant une analyse LC-MS pour éviter une mauvaise chromatographie.
Le DMSO est un oxydant doux
Le DMSO oxyde les thiols libres en disulfures; en tampon aqueux, vers pH 3 à 8, on s’en sert délibérément pour former des ponts disulfure dans les peptides. Un peptide à cystéine dans une solution mère au DMSO peut donc se dimériser ou se cycliser; c’est pourquoi JPT et GenScript passent au DMF. Pour la méthionine, les données sont plus minces : l’inventeur de la méthode n’a signalé aucune réaction indésirable avec la méthionine dans ces conditions aqueuses, alors que Hoofnagle et coll. notent qu’une oxydation de la méthionine peut survenir dans les solutions mères conservées dans le DMSO pur. Traitez-la comme une précaution de conservation.
Limiter le DMSO final
Dans les méthodes cellulaires, la concentration finale de DMSO est couramment maintenue à 1 % (v/v) ou moins; JPT et STEMCELL Technologies donnent toutes deux ce plafond. De nombreuses méthodes cellulaires en emploient moins : suivez la méthode. Planifiez la solution mère à rebours à partir de cette limite : une solution mère dans le DMSO pur diluée 1:100 dans l’essai donne 1 % de DMSO, et diluée 1:1000, 0,1 %. Bachem rappelle que de fortes concentrations de solvants organiques sont incompatibles avec les cellules.
Pourquoi le PBS s’ajoute-t-il après la dissolution du peptide?
Les sels nuisent à la solubilité : un tampon comme le PBS n’est donc pas le premier solvant d’une solution mère concentrée. Les sels s’ajoutent une fois le peptide entièrement dissous.
Hoofnagle et coll. donnent cet ordre pour les étalons peptidiques. Sigma-Aldrich ajoute une raison pratique : si un peptide ne se dissout pas dans un tampon d’essai qui contient des sels non volatils, il est difficile de le récupérer débarrassé de ces sels.
L’ordre n’est pas absolu. Bachem recommande le PBS à pH 7,0 à 7,4 lorsqu’une concentration de 1 mg/mL ou moins suffit, et Thermo Fisher indique l’eau stérile ou un tampon à pH 7 comme le PBS, le Tris ou le phosphate pour ses peptides standard.
Pour une solution mère concentrée, ou une séquence dont le comportement est inconnu, l’eau ou un premier solvant volatil passe en premier et le tampon ensuite. Tout ce qui est destiné à la LC-MS demande des tampons volatils plutôt que le PBS; la section sur l’analyse, plus bas, explique pourquoi.
Diluants avec agent de conservation
L’eau additionnée d’alcool benzylique (vendue sous le nom d’eau bactériostatique) est un diluant avec agent de conservation, et non un choix de solvant de laboratoire.
Il s’agit d’eau stérile additionnée d’alcool benzylique comme agent de conservation, généralement à 0,9 %, soit 9 mg/mL, avec un pH compris entre 4,5 et 7,0. L’agent de conservation permet d’ouvrir et d’échantillonner un même contenant à plusieurs reprises. Au Canada, c’est un médicament autorisé (DIN 00038202), et aucun des guides de solubilité de fournisseurs consultés pour cette page ne l’indique comme solvant de peptide.
L’alcool benzylique est cytotoxique pour les cellules en culture. Dans une étude publiée sur des cellules en culture, il s’est montré toxique en 5 minutes à 9 mg/mL et, à 0,225 mg/mL, il a causé des dommages et altéré la fonction cellulaire au bout de 2 heures; à 0,0225 mg/mL, il n’a pas nui aux cellules.
Les agents de conservation de ce type peuvent aussi favoriser l’agrégation. Dans une étude de formulation d’une protéine, la dissolution d’une protéine lyophilisée dans l’alcool benzylique à 0,9 % a produit plus d’agrégation que sa dissolution dans l’eau, même si l’alcool benzylique n’a pas accéléré l’agrégation pendant la conservation ultérieure à température ambiante.
La dilution ne l’élimine pas. Diluée 1:100 dans un essai, une solution à 9 mg/mL d’alcool benzylique en laisse encore 0,09 mg/mL : quatre fois le niveau qui n’a pas nui aux cellules dans cette étude, et 40 % du niveau qui les a endommagées au bout de 2 heures. Cette concentration n’a pas été testée elle-même, mais il faudrait une dilution 1:400 pour atteindre 0,0225 mg/mL.
Un laboratoire obtient la protection qu’offre un agent de conservation grâce à des aliquotes à usage unique et à une technique propre, sans ajouter à l’essai un composant cytotoxique qui favorise l’agrégation. Les méthodes de laboratoire choisissent donc généralement des solvants sans agent de conservation : une eau de la qualité que demande la méthode, ou l’acide, la base ou le solvant organique qu’indique la règle des charges.
Sources : la composition provient d’une étiquette de produit américaine, et le statut canadien de la Base de données sur les produits pharmaceutiques de Santé Canada. Les données sur les cellules proviennent de Chang et coll., 2008, et celles sur l’agrégation, de Roy et coll., 2005.
Comment le solvant influe-t-il sur une analyse HPLC ou LC-MS?
Un solvant de reconstitution qui convient à l’essai peut encore compromettre une analyse HPLC ou LC-MS. Vérifiez ce que la solution apportera dans l’instrument avant d’y engager l’échantillon.
Le DMSO et le DMF absorbent là où l’on lit les peptides
La longueur d’onde de coupure UV d’un solvant est celle à laquelle un trajet optique de 1 cm donne une absorbance de 1 (UA) par rapport à l’eau. L’eau et l’acétonitrile coupent à 190 nm, le méthanol à 205 nm et le TFA à 210 nm. Le DMSO et le DMF coupent tous deux à 268 nm : ils absorbent donc fortement dans les basses longueurs d’onde UV où l’on détecte les peptides.
Les acides absorbent aussi
Comme additifs de phase mobile, le TFA absorbe fortement sous 220 nm, et les acides formique et acétique sous 240 nm.
Les sels non volatils encrassent l’instrument
Les sels tampons inorganiques comme le PBS encrassent vite un spectromètre de masse. La LC-MS emploie des tampons volatils comme l’acétate ou le formiate d’ammonium, avec de l’acide formique ou acétique pour contrôler le pH et favoriser l’ionisation.
Des pics fins ou un signal fort
Le TFA est un agent d’appariement d’ions très puissant qui donne des pics de peptides fins, mais il supprime le signal d’électronébulisation par appariement d’ions et par modification de la tension superficielle. L’acide formique ne forme pas de paires d’ions : les peptides se séparent encore bien, mais les pics peuvent être plus larges. Dans certains cas, un peu de TFA, environ 0,03 %, est aussi efficace qu’un mélange d’acide formique à 0,1 % et de TFA à 0,05 %, dans des conditions compatibles avec la détection par spectrométrie de masse.
Un point de départ publié
Pour les étalons peptidiques mesurés par spectrométrie de masse, Hoofnagle et coll. formulent les peptides dans 5 à 30 % d’acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique, à 0,5 à 1 mg/mL, et proposent 5 % d’acétonitrile avec 0,1 à 1 % d’acide formique comme solution de départ générale.
Sources : la table des longueurs d’onde de coupure UV de Burdick & Jackson; Sigma-Aldrich sur la préparation des phases mobiles en HPLC; Advanced Materials Technology sur les additifs de phase mobile pour la LC-MS; Apffel et coll., 1995; Hoofnagle et coll., 2016.
Questions fréquentes sur les solvants des peptides.
Faut-il dissoudre un peptide d’abord dans l’eau ou dans un tampon?
D’abord dans l’eau. Les guides des fournisseurs et Hoofnagle et coll. dissolvent un peptide dans l’eau, ou dans un petit volume d’un acide, d’une base ou d’un solvant organique volatils, et n’ajoutent le tampon qu’une fois le peptide dissous : les sels nuisent à la solubilité, et un peptide qui ne se dissout pas dans un tampon est difficile à récupérer sans ses sels. Pour le travail analytique, utilisez une eau de type I ou une eau de qualité HPLC en bouteille; pour le travail sur cellules, une eau vendue stérile, ou filtrez-la. Bachem recommande le PBS à pH 7,0 à 7,4 lorsqu’une concentration de 1 mg/mL ou moins suffit.
Quelle concentration d’acide acétique les fournisseurs emploient-ils pour les peptides basiques?
Lorsque le comptage des charges est positif et que l’eau seule n’a pas dissous le peptide, les fournisseurs ajoutent un petit volume d’acide acétique puis diluent à l’eau : Sigma-Aldrich emploie 25 %, GenScript de 10 à 30 % et AAPPTec 30 %. Pour une solution mère courante, Sigma-Aldrich utilise l’acide acétique à 0,1 %. Comme l’acide acétique est volatil, une portion d’essai qui échoue peut être séchée puis essayée dans un autre solvant.
Bicarbonate d’ammonium ou hydroxyde d’ammonium pour un peptide acide?
L’un ou l’autre, en petit volume, suivi d’une dilution à l’eau. Sigma-Aldrich emploie du bicarbonate d’ammonium 0,1 M et vérifie que le pH final est d’environ 7; Bachem emploie l’ammoniaque aqueuse à 0,1 %, et GenScript un petit volume d’hydroxyde d’ammonium. Ni l’un ni l’autre ne convient à un peptide qui porte une cystéine libre, car celle-ci s’oxyde rapidement au-dessus de pH 7. Évitez un pH supérieur à 8, refroidissez la solution si c’est impossible, et ne relevez le pH qu’avec des bases faibles.
Quelle concentration finale de DMSO les méthodes cellulaires admettent-elles?
Elle est couramment maintenue à 1 % (v/v) ou moins, le plafond que donnent à la fois JPT et STEMCELL Technologies, et de nombreuses méthodes cellulaires en emploient moins. Une solution mère dans le DMSO pur diluée 1:100 donne 1 %, et diluée 1:1000, 0,1 %. Le DMSO ne peut pas être éliminé ensuite par lyophilisation.
Pourquoi éviter le DMSO avec la cystéine ou la méthionine?
Le DMSO oxyde les thiols libres en disulfures et sert délibérément à former des ponts disulfure dans les peptides : un peptide à cystéine dans une solution mère au DMSO peut donc se dimériser ou se cycliser, et JPT et GenScript emploient plutôt le DMF. Pour la méthionine, Hoofnagle et coll. notent qu’une oxydation peut survenir dans les solutions mères conservées dans le DMSO pur, même si l’inventeur de la méthode au DMSO n’a signalé aucune réaction indésirable avec la méthionine; traitez-la donc comme une précaution de conservation.
Quel solvant convient à un mélange de peptides?
Aucun solvant ne convient à tous les mélanges. Une approche courante dissout le mélange dans un petit volume de DMSO puis le dilue à l’eau : l’exemple de STEMCELL Technologies emploie 40 µL de DMSO et 210 µL d’eau pour une solution mère à 100 µg/mL par peptide, et garde le DMSO final de l’essai cellulaire sous 1 % (v/v). La méthode de Sigma-Aldrich pour des séries de peptides aux propriétés variées passe par l’acide acétique à 0,1 %, l’acide acétique à 10 % et l’acétonitrile à 20 % avant de recourir au DMF ou au DMSO.
Que font l’urée, la guanidine ou l’arginine à un essai?
Les agents chaotropes défont l’agrégation hydrophobe et les gels. GenScript emploie le chlorhydrate de guanidine 6 M ou l’urée 8 M, et AAPPTec l’urée 6 M, avec ou sans acide acétique à 20 %, ou le chlorhydrate de guanidine 6 M. Ils interfèrent avec la plupart des systèmes biologiques, si bien que la tolérance de l’essai fixe la limite, et l’urée carbamyle aussi lentement les extrémités N-terminales et les lysines, plus vite à chaud et à pH alcalin, ce qui gêne l’identification par MS. L’arginine freine l’agrégation dans les travaux sur les protéines à 0,1 à 2 M, mais aucun des guides de fournisseurs de peptides consultés ne la mentionne.