Un guide de référence sur la fabrication des peptides de recherche
Comment les peptides synthétiques sont fabriqués.
La plupart des peptides de recherche sont construits par voie chimique, un acide aminé à la fois, puis détachés, purifiés et lyophilisés. Chaque étape laisse sa trace dans la poudre : les impuretés qu’un passage en HPLC peut révéler, les contre-ions qui ajoutent du poids et les groupes terminaux qui modifient la charge et la masse. Ce guide suit un peptide de la séquence au certificat, afin qu’un laboratoire qui prépare une solution mère ou une méthode d’analyse sache ce que contient le matériel, et pourquoi.
Pour la recherche en laboratoire seulement. Non destiné à un usage humain ou vétérinaire.
Dans ce guide
Comment fabrique-t-on un peptide synthétique?
Un peptide synthétique est construit par voie chimique, un acide aminé à la fois, sur des billes de résine insolubles.
La méthode s’appelle la synthèse peptidique en phase solide, ou SPPS (de l’anglais solid-phase peptide synthesis). R. B. Merrifield l’a introduite en 1963, et la plupart des peptides sont aujourd’hui fabriqués ainsi. Sa forme moderne, la SPPS Fmoc, produit la majorité des peptides synthétiques; l’ancienne méthode Boc sert surtout à des travaux spécialisés.
Quatre étapes transforment une séquence en un flacon de poudre :
- L’assemblage : la chaîne est allongée sur la résine, un résidu après l’autre.
- Le clivage : un mélange acide libère la chaîne terminée et retire ses groupes protecteurs.
- La purification : la HPLC préparative sépare la cible des chaînes mal formées.
- La lyophilisation : les fractions purifiées sont séchées en poudre.
Chaque étape explique un élément que vous retrouverez sur un certificat ou dans un chromatogramme, et les sections qui suivent les présentent dans l’ordre. Elles décrivent la façon dont les peptides de recherche sont généralement fabriqués, et non le procédé d’un fabricant en particulier.
Que se passe-t-il à chaque cycle de synthèse?
Le premier acide aminé, celui qui occupera l’extrémité C-terminale, est fixé sur la résine, le plus souvent du polystyrène réticulé. La chaîne s’allonge ensuite vers l’extrémité N-terminale en répétant le même court cycle de synthèse, une fois pour chaque résidu.
- Départ : fixer le premier acide aminé à la résine
- Après la répétition : libérer, précipiter, purifier et lyophiliser
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Retirer le groupe temporaire
L’amine en bout de chaîne porte un groupe protecteur temporaire. En chimie Fmoc, une base le retire, généralement la pipéridine, souvent à 20 % dans le DMF. La méthode Boc emploie plutôt un acide modéré à cette étape.
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Laver
Comme la chaîne est ancrée à un solide, les réactifs et les sous-produits sont éliminés par filtration et lavage. Rien n’a besoin d’être purifié entre les étapes.
- 03
Coupler l’acide aminé suivant
L’acide aminé suivant arrive avec sa propre amine protégée et sa chaîne latérale encore bloquée : il ne peut donc se lier qu’à l’extrémité libre de la chaîne. En chimie Fmoc/tBu, les groupes des chaînes latérales résistent à chaque traitement basique et ne partent qu’à l’étape acide finale. Les chimistes qualifient d’orthogonale cette combinaison de groupes temporaires et permanents.
- 04
Laver de nouveau
Un second lavage élimine l’excès de réactif avant l’ajout du résidu suivant.
- 05
Bloquer les chaînes qui n’ont pas réagi
Certaines procédures ajoutent une étape facultative de coiffage (capping), qui bloque de façon permanente toute extrémité de chaîne restée non couplée. Une chaîne coiffée cesse de croître et devient une séquence tronquée, plus courte.
Ces étapes se répètent jusqu’à la mise en place du dernier résidu : deux étapes chimiques, la déprotection et le couplage, pour chaque résidu de la séquence.
Pourquoi le rendement baisse-t-il quand la chaîne s’allonge?
Aucune déprotection ni aucun couplage n’est parfaitement complet, et ces petits manques se multiplient.
Une chaîne de 70 résidus demande environ 140 étapes de déprotection et de couplage. Même si chaque étape atteint une efficacité de 99 %, seulement 24 % environ des chaînes sont complètes à la fin, en théorie. Le reste est formé de chaînes incomplètes que la purification doit éliminer.
La longueur n’est pas la seule limite. Les publications donnent souvent environ 50 résidus comme la longueur que l’on peut synthétiser couramment, mais une revue de la méthode juge ce chiffre sans signification en pratique : bien des séquences beaucoup plus courtes sont extrêmement problématiques. Le principal obstacle est l’agrégation, c’est-à-dire l’association des chaînes en croissance entre elles sur la résine. Les chimistes parlent de séquences difficiles.
- 10 résidus · 20 étapes
- 54,4 % de chaînes complètes à 97 % par étape; 81,8 % à 99 %; 90,5 % à 99,5 %
- 30 résidus · 60 étapes
- 16,1 % de chaînes complètes à 97 % par étape; 54,7 % à 99 %; 74,0 % à 99,5 %
- 70 résidus · 140 étapes
- 1,4 % de chaînes complètes à 97 % par étape; 24 % à 99 %; 50 % à 99,5 %
Proportion théorique de chaînes complètes si chaque déprotection et chaque couplage atteignent l’efficacité indiquée, à raison de deux étapes par résidu. La ligne de 70 résidus provient d’un calcul publié par un fournisseur; les lignes plus courtes appliquent le même calcul. Les synthèses réelles varient selon la séquence.
Qu’est-ce que le clivage, et pourquoi le TFA se retrouve-t-il dans la poudre?
Le clivage est la dernière étape chimique. Un seul traitement acide détache la chaîne de la résine et retire en même temps les groupes protecteurs des chaînes latérales.
La synthèse Fmoc emploie pour cette étape l’acide trifluoroacétique, généralement abrégé TFA. Il est moins dangereux que le fluorure d’hydrogène qu’exige l’ancienne méthode Boc, ce qui explique en partie pourquoi la méthode Fmoc s’est imposée.
Le mélange de clivage est surtout composé de TFA, avec quelques pour cent de piégeurs (scavengers) comme l’eau, un silane ou un thiol. Le retrait des groupes protecteurs libère des fragments réactifs, et les résidus sensibles peuvent former des adduits avec eux; les piégeurs réduisent ces réactions secondaires au minimum.
Le peptide brut est ensuite précipité hors de l’acide avec de l’éther froid.
Le TFA est un acide fort, de pKa 0,52, et il est volatil. Le TFA libre part lorsque le peptide est lyophilisé par la suite. Le TFA lié aux charges positives du peptide reste en place comme contre-ion, point que reprend plus bas la section sur les contre-ions.
Qu’est-ce que la HPLC préparative élimine, et que peut-elle manquer?
Le peptide brut est un mélange : la cible complète et toutes les chaînes qui ont mal tourné en cours de route. La HPLC en phase inverse est la méthode courante pour les séparer, et une spécification consensuelle pour les étalons peptidiques désigne la HPLC préparative en phase inverse comme méthode de purification.
La colonne est le plus souvent de la silice greffée de chaînes C18, la phase mobile est un mélange d’eau et d’acétonitrile, et on y ajoute environ 0,1 % (v/v) d’un acide comme le TFA. La séparation compte, car des impuretés peuvent mener une étude de laboratoire préliminaire à une conclusion erronée.
Un résidu manque
Une étape de déprotection ou de couplage est restée incomplète, et la chaîne a continué de croître sans ce résidu. Une séquence de délétion est plus légère que la cible de la masse de ce qui manque; la spectrométrie de masse l’identifie donc habituellement, même lorsque la chromatographie la sépare à peine.
La chaîne s’est arrêtée trop tôt
Une chaîne qui a cessé de croître, par exemple parce qu’un couplage raté a été coiffé, est plus courte que la cible. La spectrométrie de masse en tandem d’un pic mineur peut révéler ce genre d’arrêt prématuré.
Un groupe protecteur est resté en place
Un groupe protecteur de chaîne latérale qui a survécu au clivage laisse un adduit peptide–groupe protecteur. Les fragments libérés pendant le clivage peuvent aussi former des adduits avec les résidus sensibles.
Les autres sous-produits de la synthèse
La déprotection peut racémiser des résidus et donner des diastéréoisomères. Un excès de réactif peut insérer un résidu de trop. Les chaînes latérales peuvent s’oxyder, et les chaînes peuvent s’apparier en dimères et en oligomères plus gros.
Ce que la purification ne peut pas retirer
Une impureté éluée avec la cible reste dans le pic principal, et donc dans la valeur de pureté. Une seule réaction secondaire, la formation d’aspartimide, peut donner neuf sous-produits différents, dont certains sont coélués avec la cible.
La dégradation après la fabrication ajoute ses propres produits, comme les formes pyroglutamate et succinimide; le guide sur la stabilité les traite. Le guide de travaux pratiques traite du TFA et de l’acide formique en HPLC analytique.
Pourquoi les peptides purifiés sont-ils le plus souvent des sels de TFA, et comment change-t-on le sel?
Le TFA fait partie de la phase mobile de purification : un peptide purifié par HPLC en phase inverse en sort donc le plus souvent sous forme de sel de trifluoroacétate.
Le guide sur la teneur nette en peptide explique quels groupes portent un contre-ion et quel poids celui-ci ajoute à une poudre. Cette section porte sur la façon de changer le sel.
Trois voies courantes permettent d’échanger le TFA :
- Des dissolutions répétées dans de l’acide chlorhydrique dilué, chacune suivie d’une lyophilisation, ce qui donne le sel de chlorure.
- Une résine échangeuse d’ions portant le contre-ion voulu.
- Un changement d’acide dans la phase mobile pendant la purification, par exemple pour l’acide acétique, ce qui donne le sel d’acétate.
La voie de l’acide chlorhydrique est simple, mais limitée. Elle doit être répétée plusieurs fois, l’échange rapporté atteint jusqu’à environ 98 % plutôt que la totalité, et les conditions très acides peuvent dégrader le peptide. Elle ne fonctionne en outre qu’avec des acides plus forts que le TFA; elle ne peut donc pas produire un sel d’acétate. L’échange vers l’acétate se fait dans des conditions nettement plus douces.
Les chapitres 〈503〉 et 〈503.1〉 de l’USP sont des procédures pharmacopéennes pour mesurer l’acétate et le trifluoroacétate dans les peptides.
Le trifluoroacétate résiduel peut interférer avec certaines méthodes cellulaires; c’est une des raisons pour lesquelles les laboratoires vérifient la forme saline avant ce type de travaux.
Que changent l’acétylation N-terminale et l’amidation C-terminale?
Les extrémités d’un peptide peuvent rester libres ou être modifiées. Chaque modification retire une charge terminale et change la masse, deux éléments qui comptent lorsque le peptide est dissous ou analysé.
L’amine libre est coiffée
- Charge : la charge positive de l’extrémité N-terminale libre disparaît.
- Masse : environ 42 Da de plus que la chaîne à amine libre.
- Fabrication : la chaîne terminée peut être acétylée pendant qu’elle est encore sur la résine, avant le clivage.
- Contre-ions : une extrémité N-terminale acétylée ne porte pas de contre-ion; le sel en compte donc un de moins.
L’acide libre devient un amide
- Charge : la charge négative de l’extrémité C-terminale libre disparaît.
- Masse : environ 1 Da de moins que l’acide libre (0,98 Da).
- Fabrication : elle dépend de la résine choisie au départ. Les résines qui forment des amides, comme Rink, PAL et MBHA, libèrent des amides; les résines acides, comme la résine Wang, libèrent des acides libres.
Partir de la séquence modifiée
- Solubilité : avec moins de charges terminales, les deux modifications rendent souvent un peptide moins soluble que sa forme non modifiée.
- Premier solvant : les groupes terminaux comptent lorsque la charge nette sert à choisir un premier solvant.
- Identité par MS : la masse attendue doit être calculée pour la séquence modifiée.
- Un même écart de 0,98 Da : la forme acide libre d’un peptide amidé est plus lourde de 0,98 Da, le même écart que la désamidation. La masse seule ne permet pas de distinguer la perte d’un amide C-terminal de la désamidation d’une asparagine ou d’une glutamine; les données de fragmentation ou la rétention le permettent.
Que signifie « API », et pourquoi GPC n’emploie-t-elle pas ce terme?
API est le sigle anglais d’active pharmaceutical ingredient, en français ingrédient actif pharmaceutique. C’est un terme de la fabrication des médicaments : il décrit la place prévue d’un matériel dans la production d’un médicament, et non son degré de pureté.
La ligne directrice ICH Q7, le guide international des bonnes pratiques de fabrication (BPF) des API, en donne cette définition : « toute substance ou tout mélange de substances destiné à être utilisé dans la fabrication d’un médicament (produit médicinal) et qui, lorsqu’il est utilisé dans la production d’un médicament, devient un ingrédient actif du produit médicamenteux » (traduction libre). Le Règlement sur les aliments et drogues du Canada définit le terme dans le même cadre, celui de la fabrication d’un produit pharmaceutique.
Les deux définitions reposent sur l’usage dans la fabrication des médicaments. Q7 précise ensuite comment les API doivent être fabriqués : selon les bonnes pratiques de fabrication et dans le cadre d’un système de gestion de la qualité, pour aider à garantir qu’ils possèdent la qualité et la pureté qu’on leur attribue.
GPC offre son matériel pour la recherche en laboratoire seulement. Elle ne l’offre ni ne le fournit pour des procédures cliniques ou diagnostiques, un usage personnel ou domestique, ou son incorporation dans des produits destinés à de tels usages, et elle ne fournit pas de matériel qualifié pour la libération de produits réglementés. GPC n’emploie donc pas le terme API pour son matériel, ni aucune appellation de qualité empruntée à la fabrication des médicaments. Elle le décrit par des valeurs mesurées, comme celles que rapporte le certificat d’un lot.
Comment un peptide purifié devient-il la poudre d’un flacon?
Les fractions purifiées sont regroupées, puis lyophilisées.
La lyophilisation retire l’eau et l’acide volatil de la phase mobile. Les contre-ions liés au peptide restent, et un peu d’eau demeure : la poudre n’est donc pas entièrement du peptide.
La teneur nette en peptide, soit la part d’un échantillon pesé qui est du peptide une fois l’eau et les contre-ions exclus, se mesure habituellement par analyse des acides aminés. Le guide sur la teneur nette en peptide montre comment elle se combine à la pureté HPLC.
Un certificat rassemble les étapes décrites ici : la pureté HPLC pour ce que la purification a laissé, un spectre de masse pour l’identité et, lorsqu’un laboratoire l’a mesuré, le contenu net. Le guide de lecture des COA en présente les champs un à un.
Questions fréquentes sur la synthèse des peptides.
Comment se déroule la synthèse peptidique en phase solide?
L’acide aminé C-terminal est fixé sur des billes de résine insolubles, et la chaîne s’allonge vers l’extrémité N-terminale d’un résidu par cycle de synthèse : on retire le groupe protecteur temporaire du bout de la chaîne, on lave, on couple l’acide aminé protégé suivant et on lave de nouveau. Dans la méthode Fmoc, qui produit aujourd’hui la plupart des peptides synthétiques, une base comme la pipéridine retire ce groupe temporaire, tandis que les groupes des chaînes latérales restent en place jusqu’à l’étape acide finale.
En quoi la pureté HPLC diffère-t-elle de la teneur nette en peptide?
La pureté HPLC est la part de l’aire des pics détectés qui revient au pic principal. La teneur nette en peptide est la part du poids de la poudre qui est du peptide, sans l’eau ni les contre-ions. Une poudre peut afficher une pureté élevée et contenir quand même un cinquième de contre-ions et d’eau. Le guide sur la teneur nette en peptide présente un exemple chiffré et explique pourquoi les laboratoires multiplient les deux valeurs plutôt que d’en choisir une.
Le sel de TFA compte-t-il dans les essais cellulaires?
Il peut compter. Les peptides purifiés par HPLC en phase inverse sont le plus souvent des sels de TFA. Dans une étude sur des cellules en culture, le trifluoroacétate à des concentrations de 10⁻⁸ à 10⁻⁷ M a réduit le nombre de cellules, et les auteurs recommandaient de convertir les peptides en chlorhydrate ou en un sel équivalent avant ce type de travaux. Lorsqu’une méthode y est sensible, les laboratoires emploient un sel d’acétate ou de chlorure, ou échangent d’abord le contre-ion.
Que sont les impuretés de délétion et de troncature?
Il manque à une séquence de délétion un ou plusieurs résidus internes, parce qu’une étape de déprotection ou de couplage est restée incomplète et que la chaîne a continué de croître. Une séquence tronquée a cessé de croître trop tôt, par exemple après le coiffage d’une extrémité qui n’avait pas réagi. Les deux sont plus légères que la cible; la spectrométrie de masse les identifie donc habituellement. La HPLC préparative en élimine la plupart, mais pas une impureté coéluée avec la cible.
Quelle pureté une méthode de laboratoire exige-t-elle?
Il n’y a pas de seuil unique; l’exigence dépend de la mesure. Une spécification consensuelle pour les peptides servant d’étalons en spectrométrie de masse demande un pic principal de plus de 95 % de l’aire HPLC, avec une teneur nette en peptide confirmée par analyse des acides aminés. Les mêmes auteurs acceptent un pic principal de plus de 50 % pour le travail de criblage, à condition que la cible soit le pic le plus élevé du chromatogramme. Pour un travail quantitatif, la pureté seule ne suffit pas : l’identité et la teneur nette doivent aussi être connues.
Pourquoi GPC ne qualifie-t-elle pas ses peptides d’API?
Parce que ce terme appartient à la fabrication des médicaments. Selon ICH Q7, un ingrédient actif pharmaceutique est une substance destinée à la fabrication d’un produit médicamenteux. GPC offre son matériel pour la recherche en laboratoire seulement, et le décrit par des valeurs mesurées, comme celles du certificat d’un lot.