Un guide de référence pour conserver les solutions de laboratoire
Conservation des solutions de peptides reconstituées : aliquotes, congélation, contenants et filtres.
Une solution mère de peptide préparée par reconstitution pour un essai ou un étalon analytique commence à changer dès sa préparation. Ce guide explique comment un laboratoire conserve cette solution pour que sa concentration reste mesurable : aliquotes, congélation et décongélation, contenants, filtres et registres. Chaque durée de conservation citée ici est attribuée à sa source publiée.
Pour la recherche en laboratoire seulement. Non destiné à un usage humain ou vétérinaire.
Dans ce guide
Pourquoi une solution de peptide change-t-elle plus vite que la poudre?
Une solution mère de peptide est beaucoup moins stable que la poudre lyophilisée dont elle provient.
Bachem déconseille de conserver les peptides en solution, même stérile et exempte d’oxygène, parce qu’ils peuvent lentement se dégrader, et GenScript qualifie de très limitée leur durée de vie en solution.
Une solution conservée peut changer de trois façons :
- Sa chimie change. NIBSC, Bachem et GenScript rangent les séquences qui contiennent de la cystéine, de la méthionine, du tryptophane, de l’asparagine ou de la glutamine parmi celles dont la durée de vie en solution est plus courte; leurs listes diffèrent légèrement.
- Sa concentration change sans aucune chimie. Dans leurs recommandations sur les étalons peptidiques pour la spectrométrie de masse, Hoofnagle et ses collègues (2016) comptent l’évaporation et l’adsorption sur les surfaces parmi les principaux problèmes d’une conservation prolongée, avec la croissance microbienne, que les solutions tamponnées peuvent favoriser.
- La dilution aggrave les deux. Selon Thermo Fisher, plus la concentration est faible, plus la solution est instable.
Lorsque la séquence le permet, NIBSC et GenScript recommandent de conserver les peptides en solution dans un tampon à pH 5 à 6 environ, et NIBSC précise qu’il doit être stérile. Un peptide dont le point isoélectrique se situe près de cette plage peut y être le moins soluble; la solubilité passe donc en premier, et le guide sur la charge et le pH explique comment la vérifier.
Beaucoup de peptides sont aussi sensibles à la lumière : Thermo Fisher recommande de garder les solutions à l’abri de la lumière directe, et Hoofnagle et ses collègues préconisent des tubes ambrés ou opaques pour les séquences photosensibles.
Une solution mère excédentaire peut être lyophilisée de nouveau, comme GenScript et Thermo Fisher le recommandent pour une conservation plus longue; le guide sur la lyophilisation décrit ce qui change.
Combien de temps une solution mère de peptide reste-t-elle stable?
La littérature ne donne pas de valeur unique. Selon la source, la concentration et la température, les recommandations publiées vont de quelques semaines à environ un an.
Les valeurs de Hoofnagle visent les étalons de spectrométrie de masse, généralement dans 5 à 30 % d’acétonitrile avec 0,1 à 1 % d’acide formique, et leur tableau classe une solution congelée à concentration élevée dans la conservation à moyen terme, de trois mois à un an, selon le peptide. Les « quelques semaines » de Bachem sont une indication générale de manipulation. Ni l’une ni l’autre ne décrit votre solution.
La réponse fiable est donc une réponse mesurée : conservez la solution comme prévu et comparez-la à une préparation fraîche à des moments fixés d’avance. Le guide sur la stabilité montre comment concevoir cette étude.
- NIBSC
- Conserver les aliquotes à −20 °C ou moins dans la mesure du possible, dans un tampon stérile à pH 5 à 6 environ.
- Votre laboratoire
- La seule valeur qui s’applique à votre séquence, à votre solvant, à votre contenant et à votre méthode.
Ces valeurs sont attribuées à leurs sources publiées. Aucune ne constitue une allégation de stabilité pour un produit GPC ni pour une solution préparée à partir de celui-ci.
Comment répartir une solution mère en aliquotes?
Les aliquotes permettent à chaque analyse de ne décongeler que ce dont elle a besoin, de sorte que le reste de la solution mère n’est jamais recongelé. Bachem, NIBSC et GenScript le recommandent tous, avec une conservation au congélateur sous −15 °C ou à −20 °C ou moins, selon la source.
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Garder la solution mère concentrée
Conservez la solution mère concentrée et préparez les dilutions de travail le plus près possible du moment de l’analyse, comme le recommandent Hoofnagle et ses collègues pour les étalons. Une solution diluée change plus vite et perd une plus grande part de son peptide sur la paroi du tube.
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Prévoir une aliquote par analyse
Aucune source publiée ne fixe de volume minimal. Dimensionnez chaque aliquote en µL pour une analyse et sa répétition, afin qu’aucun tube ne soit décongelé deux fois. Le pipetage fixe la limite pratique : le calculateur de concentration demande une vérification de la précision pour les transferts de moins de 10 µL et exige une dilution intermédiaire sous 2 µL.
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Adapter le tube au volume
Un petit volume dans un grand tube a plus de paroi par microlitre, et une plus grande part de son peptide finit sur cette paroi. Kristensen et ses collègues (2015) l’ont mesuré à 2 µM dans du verre borosilicaté : la récupération d’un peptide était de 39 % dans 220 µL et de 87 % dans 2 mL. Choisissez un tube proche du volume de l’aliquote.
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Choisir le matériau avec soin
Selon NIBSC, les flacons de verre et de plastique conviennent généralement : le polypropylène est solide et chimiquement inerte, le verre est préférable lorsque la visibilité compte, et les plastiques exigent des précautions avec les solvants organiques.
Que font la congélation, le congélateur et l’air à une solution conservée?
La congélation ralentit la chimie, mais elle apporte ses propres problèmes. Quatre méritent d’être prévus.
Décongeler chaque aliquote une seule fois
Toutes les sources citées ici déconseillent les cycles de congélation-décongélation répétés, mais les mesures donnent un portrait plus nuancé. Dans une étude LC-MS contrôlée portant sur des aliquotes de peptides à 1 µM conservées à −80 °C, dix cycles de congélation-décongélation n’ont pas modifié de façon significative l’aire moyenne des pics, mais ils ont rendu les aires plus variables que toute autre condition. Les auteurs concluent qu’il faut réduire au minimum les cycles de congélation-décongélation.
La congélation concentre ce qui est dissous
À mesure que la glace se forme, le peptide, les sels et le tampon se concentrent dans le liquide restant, et le pH peut changer avec eux. Gómez et ses collègues ont observé qu’un tampon phosphate de sodium à pH 7,4 atteignait pH 4,2 à −10 °C à 50 et 100 mM, et pH 5,2 à 8 mM. Un tube décongelé peut ne pas être homogène : mélangez-le doucement et centrifugez-le brièvement avant de pipeter.
Éviter le dégivrage automatique
Un congélateur sans givre se réchauffe périodiquement pour faire fondre sa glace. NIBSC le déconseille pour les peptides, car sa température varie énormément pendant les dégivrages automatiques fréquents. Conservez les aliquotes congelées dans un congélateur à dégivrage manuel à −20 °C ou moins, ou à −70 °C ou moins pour les solutions mères concentrées gardées plus longtemps.
Limiter l’air pour les séquences sujettes à l’oxydation
La cystéine, la méthionine et le tryptophane s’oxydent facilement, et Hoofnagle et ses collègues signalent que la réaction s’accélère pendant les cycles de congélation-décongélation ainsi qu’à pH élevé. GenScript limite l’air en purgeant les tampons à l’argon ou à l’azote et en gardant les flacons bien fermés, et Hoofnagle et ses collègues ajoutent un gaz inerte de couverture pour les séquences particulièrement sensibles. Bachem dissout un peptide porteur d’une cystéine libre dans un tampon acide dégazé, car les thiols s’oxydent rapidement au-dessus de pH 7. Un agent réducteur comme le DTT n’est une option que si la méthode le tolère.
Pourquoi une solution diluée perd-elle du peptide sur son contenant?
En solution, les peptides s’adsorbent sur les parois des tubes et des flacons, sur les pointes de pipette et sur les cuves, et à forte dilution la perte peut être importante.
Une surface ne peut retenir qu’une quantité limitée de peptide. Une paroi se comporte un peu comme un buvard sous une goutte d’encre : elle retient une quantité à peu près fixe. Dans une solution concentrée, cette quantité est une petite part du total; dans une solution diluée, elle peut en représenter l’essentiel.
Hoofnagle et ses collègues attribuent la perte relative plus forte à faible concentration à la capacité de liaison limitée de la surface mouillée, et NIBSC prévient qu’à forte dilution, l’adsorption peut fausser gravement les mesures qui suivent.
- VerrePerte : 86 % à 1 µM; 22 % à 20 µM.
- PolypropylènePerte : 88 % à 1 µM; 15 % à 20 µM.
- Polypropylène à faible adsorptionPerte : 24 % à 1 µM; 7 % à 20 µM.
Tableau des pertes par adsorption
| Contenant | 1 µM | 2 µM | 5 µM | 10 µM | 20 µM |
|---|---|---|---|---|---|
| Verre | 86 % | 72 % | 44 % | 30 % | 22 % |
| Polypropylène | 88 % | 58 % | 32 % | 20 % | 15 % |
| Polypropylène à faible adsorption | 24 % | 19 % | 11 % | 11 % | 7 % |
- 1 µM, verre ou polypropylène
- Récupération de seulement 10 à 20 % pour trois peptides cationiques après 1 h dans 220 µL à pH 7,4 (Kristensen et coll.)
- 1 µM, tubes à faible adsorption
- Récupération de 62 à 90 % dans les mêmes conditions
- 20 µM, verre ou polypropylène
- Récupération moyenne d’environ 78 à 85 %
- Quatre transferts à 5 µM
- Récupération proche de 0 % après quatre contenants successifs en verre ou en polypropylène, contre 64 à 74 % dans des tubes à faible adsorption
- 0,2 µM contre 1 µM
- Dans des flacons de verre non traités, sur 15 h d’analyses LC-MS horaires, 9 peptides sur 50 ont montré une baisse de signal à 0,2 µM et aucun à 1 µM (Hoofnagle et coll.)
Les trois peptides de Kristensen sont fortement cationiques et ont été mesurés à pH 7,4; les valeurs pour les tubes à faible adsorption et à 20 µM sont recalculées à partir du jeu de données publié avec l’article. D’autres séquences peuvent perdre plus ou moins : mesurez les vôtres.
Comment les laboratoires réduisent-ils les pertes sur le verre et le plastique?
Aucun contenant n’est le meilleur pour tous les peptides : le but est de limiter la perte, puis de mesurer ce qui reste.
Verre ou polypropylène : vérifier plutôt que supposer
Hoofnagle et ses collègues décrivent des résidus basiques qui se lient aux groupes silanol du verre et des résidus non polaires qui se lient au polypropylène, et dans leur comparaison LC-MS à 50 nM, les flacons de polypropylène n’ont montré qu’un seul peptide instable, contre 13 et 14 dans le verre non traité et le verre désactivé. Pourtant, Goebel-Stengel et ses collègues (2011), avec huit peptides radiomarqués de charges et de tailles différentes, n’ont trouvé ni surface idéale pour tous ni tendance liée à la charge : la récupération allait d’environ 9 % à 86 %.
Ils aident sans supprimer la perte
À 1 µM, la récupération des trois peptides cationiques atteignait 62 à 90 % dans des tubes en polypropylène à faible adsorption, contre 10 à 20 % dans le verre et le polypropylène, et une étude LC-MS indépendante a obtenu des mesures répétées plus cohérentes avec des tubes à faible rétention qu’avec des microtubes standard. Ce n’est pas une garantie : à 2 µM dans 2 mL, un peptide ne s’est pas mieux comporté dans ces tubes que dans le verre ou le polypropylène.
La BSA aide si la méthode le permet
Dans l’étude de Goebel-Stengel, 1 % de BSA a amélioré la récupération de la plupart des peptides sans jamais accroître la perte, mais la BSA est exclue de certains travaux de spectrométrie de masse, et Hoofnagle et ses collègues ne relèvent aucun consensus sur le choix de la protéine porteuse ni sur sa concentration. Une protéine porteuse ajoute aussi sa propre absorbance UV et ses propres pics : mesurez donc d’abord la solution mère, et n’ajoutez la protéine porteuse qu’aux dilutions de travail dont la méthode la tolère.
Pointes, transferts et prérinçage
Chaque pointe, chaque tube et chaque transfert ajoute de la surface. Hoofnagle et ses collègues recommandent une pointe neuve pour chaque dilution, prérincée plusieurs fois avec la solution, et l’ajout du peptide directement dans le diluant plutôt que sur la paroi du tube. Ils suggèrent aussi de laver d’abord les tubes avec la même solution, alors que Kristensen et ses collègues préviennent qu’une paroi présaturée peut ensuite relâcher du peptide dans la solution.
Mesurer la perte dans vos propres contenants
Hoofnagle et ses collègues décrivent une vérification directe : transférer une solution d’un flacon à l’autre et analyser une petite aliquote après chaque transfert. L’absorbance UV d’une série de dilutions, ou des passages LC-MS répétés, révèlent de la même façon les pertes dans les tubes, les pointes et les flacons. La Politique d’utilisation pour la recherche de GPC compte les études de contenants et de surfaces parmi ses exemples de travaux de laboratoire permis.
Faut-il filtrer une solution mère de peptide, et sur quelle membrane?
Ne filtrez que si la méthode l’exige, et filtrez alors la solution mère concentrée une seule fois plutôt que chaque solution de travail diluée.
Une membrane est une surface de plus, et une solution qui la traverse rencontre toute sa structure interne. Comme la paroi d’un contenant, elle ne retient qu’une quantité limitée de peptide : la même perte représente donc une part plus petite d’une solution concentrée. C’est un raisonnement tiré des données d’adsorption présentées plus haut, et non une étude mesurée de la filtration des peptides.
Le guide de filtration de Corning classe les porosités de membrane selon leur usage :
- 0,2 ou 0,22 µm : stérilisation courante au laboratoire de la plupart des milieux, des tampons, des liquides biologiques et des gaz.
- 0,45 µm ou plus : clarification et préfiltration des solutions et des solvants.
- 0,1 µm : élimination des mycoplasmes.
GenScript présente la filtration sur 0,2 µm comme une option pour éliminer une éventuelle contamination bactérienne d’une solution de peptide. Elle n’établit pas la stérilité au-delà des besoins d’une méthode, comme l’explique le guide sur la préparation d’une solution mère.
Une solution mère trouble ne se filtre pas. NIBSC note qu’une solution qui a gélifié, qui reste trouble ou qui porte une pellicule en surface n’est probablement pas dissoute, mais finement en suspension; filtrer une suspension retire du peptide au lieu de le dissoudre. Posez d’abord un diagnostic à l’aide du guide de dépannage.
Les classements de membranes ci-dessous reposent sur des données de protéines. Pour un peptide, ils sont un point de départ, et c’est la récupération mesurée sur votre propre membrane qui fait foi : si la méthode dépend de la concentration, mesurez-la après la filtration.
- Acétate de cellulose et PES
- Liaison protéique très faible (Corning). L’acétate de cellulose sans tensioactif est la plus faible; l’acétate de cellulose ordinaire contient moins de 1 % d’agent mouillant, qu’un peu d’eau purifiée tiède suffit à éliminer.
- Cellulose régénérée
- Liaison protéique faible, et le meilleur choix de Corning pour le DMSO.
- PVDF hydrophile
- Rangé par KNAUER avec l’acétate de cellulose et le PES parmi les membranes à faible liaison protéique. Le PVDF destiné au buvardage lie fortement les protéines : précisez « hydrophile ».
- Nylon
- Liaison faible à modérée (Corning), et KNAUER le déconseille pour les échantillons riches en protéines. Il résiste mieux aux alcools et au DMSO.
- Nitrate de cellulose
- Liaison très élevée (Corning), pour les solutions où la liaison protéique n’a pas d’importance.
Pour une solution mère dans le DMSO, la compatibilité avec le solvant décide d’abord : la cellulose régénérée tolère le DMSO, alors que le PES a une faible résistance chimique. Le PTFE doit être prémouillé avec un solvant comme l’éthanol avant qu’une solution aqueuse puisse le traverser.
Que doivent indiquer l’étiquette et le registre?
Une aliquote conservée ne vaut que par son étiquette. Quiconque ouvre le congélateur devrait pouvoir savoir ce que contient le tube, comment la solution a été préparée et ce qui lui est arrivé depuis.
Inscrivez ces renseignements sur le tube ou son étiquette cryogénique, et dans le cahier de laboratoire :
- Identité : le composé et son numéro de lot.
- Concentration : la valeur et sa base, poudre pesée ou valeur corrigée pour la teneur nette en peptide.
- Solvant : le solvant ou le tampon, et son pH.
- Préparation : la date et les initiales de la personne qui a préparé la solution.
- Aliquote : son numéro et son volume en µL.
- Conservation : l’emplacement et la température.
- Historique : le nombre cumulé de cycles de congélation-décongélation, pour tout tube qui retourne au congélateur.
Écrivez avec un marqueur résistant aux solvants ou sur une étiquette cryogénique imprimée, et gardez le registre des températures du congélateur avec le cahier, pour que tout écart soit consigné à côté des aliquotes qu’il a touchées.
Le guide sur la préparation d’une solution mère décrit la fiche établie au moment de la préparation; ces champs sont ceux qu’ajoute la conservation.
Quand une solution conservée doit-elle être mesurée de nouveau?
Mesurez de nouveau une solution conservée avant qu’elle serve d’étalon ou de solution d’étalonnage, chaque fois que l’un de ces cas se présente.
- Son aspect a changé : turbidité, particules, gel ou changement de couleur.
- Le congélateur a subi un écart de température.
- Elle est conservée depuis plus longtemps que ce que couvrent vos propres données.
- Les étalons de la méthode ont dérivé de façon inattendue.
- Le tube a été recongelé après une décongélation.
Mesurez la concentration, par absorbance UV ou par l’aire du pic HPLC par rapport à une référence fraîchement préparée, et le profil d’impuretés : pics nouveaux ou déplacés, identifiés par LC-MS à l’aide du tableau des écarts de masse du guide sur la stabilité.
Comme modèle, Hoofnagle et ses collègues proposent un ensemble minimal de vérifications de stabilité pour les étalons de spectrométrie de masse : 6 h et 24 h à 4 °C, 4 semaines à −70 °C, et un puis deux cycles de congélation-décongélation, chacun comparé au temps zéro.
Ce que vous constatez s’applique à cette solution, conservée de cette façon, et ne fixe aucune date de péremption.
Pour faire analyser le matériel lui-même, une solution préparée n’est pas le bon échantillon : le guide sur l’analyse explique pourquoi les laboratoires ont besoin du flacon scellé d’origine.
Questions fréquentes sur la conservation des solutions de peptides.
Combien de temps une solution mère de peptide reste-t-elle stable à 4 °C, à −20 °C ou à −80 °C?
La littérature ne donne pas de valeur unique. Bachem indique que les solutions congelées « peuvent se conserver quelques semaines » sous −15 °C, alors que Hoofnagle et ses collègues, qui traitent des étalons de spectrométrie de masse, classent dans le court terme une conservation d’au plus trois mois, à l’état liquide à 4 °C ou congelée entre −20 et −80 °C, pour les solutions de 1 à 100 µM, selon le peptide. La seule valeur fiable est celle que mesure votre propre méthode, et GPC ne fait aucune allégation de stabilité pour une solution préparée à partir de ses produits.
La congélation et la décongélation répétées modifient-elles une solution de peptide?
Les fournisseurs recommandent de les éviter. Dans une étude LC-MS contrôlée, dix cycles de congélation-décongélation d’aliquotes de peptides à 1 µM n’ont pas modifié de façon significative l’aire moyenne des pics, mais ont rendu les aires plus variables, et les auteurs concluent qu’il faut réduire au minimum les cycles de congélation-décongélation. Des aliquotes à usage unique, décongelées une seule fois, évitent la question.
Faut-il filtrer une solution mère de peptide sur 0,22 µm ou sur 0,45 µm?
Seulement si la méthode l’exige. Une membrane de 0,2 ou 0,22 µm est la porosité courante au laboratoire pour éliminer les bactéries, et 0,45 µm sert à la clarification et à la préfiltration. Filtrez la solution mère concentrée une seule fois, car une membrane ne retient qu’une quantité limitée de peptide, et jamais une solution mère trouble : c’est une suspension, que la filtration appauvrit en peptide.
Comment savoir si le peptide a été perdu sur un filtre ou s’il a changé?
Analysez côte à côte par HPLC le filtrat et une portion non filtrée de la même solution mère. Un pic principal plus petit sans nouveaux pics indique une perte sur la membrane; des pics nouveaux ou déplacés indiquent un changement chimique, que le tableau des écarts de masse du guide sur la stabilité aide à identifier. Si la récupération est plus élevée dans les dernières fractions de filtrat que dans la première, ce profil concorde avec une adsorption, car la capacité de liaison de la membrane se sature.
Pourquoi la concentration mesurée d’une solution diluée est-elle plus faible que la valeur calculée?
Une surface retient une quantité de peptide à peu près fixe, de sorte que la part perdue augmente à mesure que la concentration baisse, et chaque contenant, chaque pointe et chaque transfert ajoute de la surface. Vérifiez aussi la base de quantité et le pipetage à l’aide du guide sur la teneur nette et du calculateur de concentration, puis gardez la solution mère concentrée et faites la dilution finale dans le contenant d’analyse juste avant le passage.