Préparation de solutions de laboratoire
Calculateur de reconstitution et de dilution des peptides.
Ce calculateur établit la concentration d’une solution mère de laboratoire préparée par reconstitution d’un peptide lyophilisé, ainsi que les volumes des solutions de travail et des dilutions en série qui en découlent. Vous saisissez vous-même chaque valeur. Sous l’outil, la page explique le calcul et les limites pratiques de chaque valeur : teneur nette, masse moléculaire, précision du pipetage, déplacement de volume et capacité du contenant.
Pour la recherche en laboratoire seulement. Non destiné à un usage humain ou vétérinaire.
Sur cette page
Calculateur de solutions de laboratoire
Cet outil calcule les concentrations de solutions de laboratoire. GPC ne donne aucun conseil relatif à l’administration.
Information générale de laboratoire.
La teinte du flacon est illustrative; son opacité suit une échelle logarithmique de concentration.
Comment la masse, le volume et la concentration sont-ils liés?
La concentration est la quantité de peptide divisée par le volume de la solution finale.
Il s’agit du volume de la solution, et non du volume de solvant ajouté. Le guide du NIST sur l’usage du SI définit une concentration par rapport au volume du mélange, et une concentration massique est simplement une masse divisée par ce volume, exprimée en mg/mL ou en µg/mL.
Le calculateur fonctionne dans les deux sens :
- Concentration = quantité ÷ volume. Entrez une quantité et un volume de solvant : le mode Solution mère donne la concentration.
- Volume = quantité ÷ concentration. Entrez une quantité et une concentration visée : le même mode donne le volume de solvant qui permet de l’atteindre.
En laboratoire, la reconstitution transforme une quantité connue de peptide lyophilisé en solution mère, et toutes les concentrations qui suivent sur cette page découlent de cette quantité et de ce volume.
Toute conversion entre concentrations massiques est une puissance de dix exacte : passer des mg/mL aux µg/mL revient à multiplier ou à diviser par 1 000, sans rien changer d’autre.
Dans une fiole jaugée remplie jusqu’au trait de jauge, le volume final est exact. Dans un flacon, il correspond au volume de solvant plus le petit volume qu’occupe le peptide dissous lui-même. Sous environ 14 mg/mL, ce surplus représente moins de 1 % du volume; la section sur le déplacement de volume traite du reste.
- Massem
- Concentrationc = m ÷ V
- Volume final de la solutionV
- mg/mL
- Milligrammes par millilitre, soit des grammes par litre
- µg/mL
- Microgrammes par millilitre, soit des milligrammes par litre; 1 mg/mL = 1 000 µg/mL
- mM, µM, nM
- Millimoles, micromoles et nanomoles par litre, qui exigent une masse moléculaire
- NIST SP 811, § 8.6.5
- La concentration se définit par rapport au volume du mélange
Ajouter du solvant ajoute-t-il du peptide?
Non. Ajouter du solvant ajoute du volume, jamais du peptide.
La quantité de peptide est fixée par ce qui a été pesé ou par ce que renfermait le contenant. Le solvant ne change que le volume dans lequel cette quantité se répartit : la concentration baisse donc en proportion de la hausse du volume. Deux fois plus de volume, deux fois moins de concentration. Un plus grand volume peut sembler contenir plus de matière; c’est la même matière, simplement plus diluée.
Deux images pour s’en souvenir :
- De l’encre dans deux fioles. Versez une goutte d’encre dans une fiole de 10 mL et une goutte identique dans une fiole de 100 mL. Les deux contiennent la même encre, mais la plus grande paraît dix fois plus pâle, parce que la même encre y est répartie dans dix fois plus de liquide. Remplir la fiole jusqu’au trait ajoute du liquide, pas de l’encre.
- Quarante billes, deux plateaux. Versez quarante billes dans un petit plateau, puis déplacez ces mêmes quarante billes dans un plateau quatre fois plus grand. Rien n’a été ajouté ni perdu, mais chaque carré du grand plateau en contient quatre fois moins. Les étaler ne crée jamais une quarante et unième bille.
La dilution change aussi la fiabilité d’une solution. Les parois d’un contenant ne peuvent fixer qu’une quantité limitée de peptide : la part perdue sur la paroi est faible dans une solution concentrée et importante dans une solution diluée (Hoofnagle et coll., 2016). Dans le mélange d’étalonnage peptidique d’un fabricant, trois peptides sur quinze donnent un signal inférieur de 20 à 60 % lorsqu’ils sont conservés à la concentration la plus faible, et le fabricant juge la version plus concentrée mieux adaptée aux courbes de dilution quantitatives.
C’est pourquoi on garde les solutions mères concentrées et qu’on en dilue les solutions de travail le plus près possible du moment où la méthode les analyse. Le guide sur la conservation traite en détail des surfaces des contenants et des faibles concentrations.
- 100 µL10,00 mg/mL
- 1 mL1,000 mg/mL
- 10 mL0,1000 mg/mL
Quand un calcul exige-t-il la masse moléculaire?
Seulement lorsque la concentration est molaire. Une concentration molaire compte des molécules plutôt que des milligrammes, et la masse moléculaire permet de passer de l’une à l’autre.
La concentration molaire est une quantité de matière par litre : mM désigne des millimoles par litre (mmol/L), µM des micromoles par litre et nM des nanomoles par litre. Le NIST considère le terme « molarité » et le symbole M employé seul comme désuets, mais mM, µM et nM restent l’abréviation courante en laboratoire, et le calculateur les emploie en ce sens.
La conversion découle des définitions. Comme 1 mg/mL équivaut à 1 g/L, diviser une concentration massique par la masse moléculaire en g/mol donne des mol/L, et les facteurs ci-dessous convertissent cette valeur en mM, en µM ou en nM. Le peptide A à 5,000 mg/mL, dont la masse moléculaire est de 1 250,0 g/mol, est à 4,000 mM, soit 4 000 µM.
La masse moléculaire doit correspondre à la base de la quantité. La teneur nette en peptide exclut déjà les contre-ions et l’eau : une masse nette de peptide ou un contenu mesuré s’associe donc à la masse moléculaire du peptide libre, celle qu’on calcule à partir de la séquence. Si un certificat donne une masse moléculaire du sel ou propre au lot, elle va avec la masse brute de poudre, jamais avec la teneur nette.
L’écart n’est pas négligeable. Les peptides purifiés par HPLC arrivent habituellement sous forme de sels de trifluoroacétate (TFA). Chaque contre-ion TFA ajoute environ 114 g/mol, et chaque acétate environ 60 g/mol. Un peptide de 1 200 g/mol portant deux contre-ions TFA pèse environ 1 428 g/mol sous forme de sel. Associer la masse moléculaire du peptide libre à une masse de sel surestime la concentration molaire d’environ 19 %, et associer celle du sel à une masse nette de peptide la sous-estime.
- µM
- mg/mL ÷ masse moléculaire (g/mol) × 1 000 000
- mM
- mg/mL ÷ masse moléculaire (g/mol) × 1 000
- nM
- mg/mL ÷ masse moléculaire (g/mol) × 10⁹
Teneur nette en peptide et pureté : multiplier plutôt que choisir
La quantité d’un calcul devrait être celle du peptide visé, et la poudre pesée n’est pas entièrement du peptide.
La masse brute d’une poudre de peptide comprend le peptide, ses contre-ions et l’eau qu’elle retient. La teneur nette en peptide est la part peptidique de cette masse, mesurée par analyse des acides aminés, par la teneur en azote ou par spectrophotométrie UV, et elle compte les impuretés peptidiques avec le peptide visé. La pureté HPLC est la part de l’aire des pics qui revient au peptide visé, vers 220 nm : elle compare entre elles les espèces qui absorbent à cette longueur d’onde, et elle ne pèse rien.
Le calculateur accepte la quantité selon l’une de trois bases et indique celle qu’il a retenue :
- Quantité indiquée sur l’étiquette : le remplissage nominal imprimé sur le contenant. C’est une valeur déclarée, et non une mesure de ce contenant.
- Contenu mesuré selon le certificat : la quantité de peptide mesurée par un laboratoire, lorsqu’un certificat d’analyse en indique une. Notez la base que déclare le certificat.
- Vos propres données : masse brute × teneur nette en peptide × pureté HPLC, le calcul que Bachem présente comme poids absolu = poids brut × pureté × teneur.
Aucun des deux pourcentages ne suffit seul. La teneur nette en peptide inclut encore les impuretés peptidiques, et la pureté HPLC ne voit ni les contre-ions ni l’eau : les laboratoires multiplient donc les deux. Avec 10,00 mg de poudre, une teneur nette en peptide de 80,0 % et 98,0 % de l’aire des pics HPLC dans le pic principal, le peptide visé représente 10,00 × 0,800 × 0,980 = 7,840 mg.
La correction compte. Lorsque le NIST a rempli les flacons d’un matériau de référence peptidique à 1 mg nominal de chaque peptide, l’analyse des acides aminés n’a retrouvé que 67 à 73 % de cette masse sous forme de peptide; le reste était des sels et de l’eau. Des fournisseurs citent des teneurs nettes typiques de 60 à 90 % ou de 50 à 90 %, plus faibles pour les séquences riches en résidus basiques comme l’arginine.
La teneur nette comporte sa propre incertitude, et les poudres de peptide absorbent l’eau de l’air, ce qui abaisse la teneur de ce qu’on pèse. Bachem recommande de laisser le contenant atteindre la température ambiante dans un dessiccateur avant de l’ouvrir et de peser. Le guide sur la teneur nette explique d’où vient chaque valeur.
- Peptide65 % · illustration
- Contre-ion25 % · illustration
- Eau10 % · illustration
- Brut × pureté × teneur
- Le calcul de Bachem pour le poids absolu du peptide visé
Dilution : C1V1 = C2V2
Concentration × volume donne la quantité, et une dilution déplace une quantité sans la modifier : C1 × V1 = C2 × V2.
C1 est la concentration de la solution mère et V1 le volume qu’on en transfère. C2 et V2 sont la concentration et le volume final de la solution de travail. Entrez trois valeurs et le calculateur trouve la quatrième; le diluant correspond à V2 − V1.
Pour préparer 1,000 mL d’une solution de travail à 100,0 µg/mL à partir d’une solution mère à 5,000 mg/mL, exprimez d’abord les deux concentrations en µg/mL : la solution mère est à 5 000 µg/mL. Ensuite, V1 = 100,0 × 1,000 ÷ 5 000 = 0,02000 mL : transférez 20,00 µL de solution mère et complétez avec 980,0 µL de diluant.
Les instructions des fabricants suivent la même équation. Thermo Scientific dilue l’un de ses mélanges d’étalonnage peptidiques en combinant 20 µL du mélange et 180 µL de tampon : 0,5 pmol/µL × 20 µL égale 0,05 pmol/µL × 200 µL, soit les 50 fmol/µL demandées.
La notation des dilutions varie selon les domaines. Dans le calculateur et sur cette page, 1:10 signifie un volume porté à dix volumes au total, soit un facteur de dilution de 10. Certains domaines écrivent la même dilution 1:9, une part plus neuf parts.
Si le diluant est un tampon comme le PBS, ajoutez-le seulement une fois le peptide entièrement dissous, car les sels nuisent à la solubilité (Hoofnagle et coll., 2016). Le guide sur les solvants traite des premiers solvants et des tampons.
- Solution mèreC₁
- Transfert à la pipetteV₁
- Solution de travailC₂ au V₂ final
Dilution en série : le même facteur à chaque étape
Dans une dilution en série, chaque tube est dilué à partir du précédent par le même facteur F : après n étapes, la concentration vaut C₀ ÷ Fⁿ.
Imaginez une rangée de tubes de colorant. Transférez une part d’une solution de colorant dans neuf parts d’eau, puis une part de ce mélange dans neuf autres. Chaque tube est dix fois moins coloré que le précédent, et l’eau de chaque tube n’a apporté aucun colorant : toute la couleur de la rangée vient du premier tube.
Les erreurs de transfert s’accumulent le long d’une série; la technique compte donc à chaque étape :
- Utilisez un embout neuf pour chaque transfert. Hoofnagle et coll. recommandent de ne jamais réutiliser les embouts dans une série de dilutions.
- Rincez l’embout plusieurs fois avec la solution avant d’aspirer le volume à transférer.
- Distribuez dans le diluant lui-même, et non sur la paroi du tube ou du flacon.
Pour un volume final V dans chaque tube, le transfert vaut V ÷ F et le diluant V − V ÷ F. Une série au 1:10 dont chaque tube est complété à 1,000 mL transfère 100 µL dans 900 µL de diluant à chaque étape.
Quatre étapes de ce type à partir d’une solution mère à 1,000 mg/mL donnent 100, 10,0, 1,00 et 0,100 µg/mL. Après le transfert suivant, les tubes 1 à 3 contiennent 900 µL; seul le dernier garde ses 1,000 mL. Le calculateur indique le transfert, le diluant et la concentration de chaque étape.
Une telle série fournit les points de concentration d’une courbe d’étalonnage ou de dilution pour une méthode HPLC ou LC-MS.
Quel est le plus petit volume qu’on peut pipeter de façon fiable?
Le calcul est exact à tout volume; une pipette ne l’est pas.
Selon METTLER TOLEDO Rainin, les pipettes manuelles monocanal à volume variable, de 2 µL à 20 mL, sont de loin les plus répandues en laboratoire. Un transfert plus petit exige une pipette spécialisée pour petits volumes, et même là, l’erreur spécifiée par le fabricant augmente fortement à mesure que le volume diminue.
Le calculateur compare chaque transfert calculé à deux seuils :
- Sous 2 µL : erreur. Le transfert sort des plages des pipettes courantes, et le calculateur propose plutôt une dilution intermédiaire.
- De 2 µL à moins de 10 µL : mise en garde. Le volume est dans la plage, mais à son extrémité basse, où l’erreur systématique spécifiée d’une pipette de 2 à 20 µL va de ±5,0 % à 2 µL à ±1,2 % à 10 µL.
Passer en une seule étape d’une solution mère à 5,000 mg/mL à 1,000 mL d’une solution à 1,000 µg/mL exigerait un transfert de 0,2000 µL, dans la zone où l’erreur systématique spécifiée va de ±12 % à 0,25 µL à ±48 % à 0,1 µL. Deux étapes l’évitent. 10,0 µL de solution mère dans 990,0 µL de diluant donnent 50,00 µg/mL, puis 20,00 µL de cette solution dans 980,0 µL donnent 1,000 µg/mL. Aucun des deux transferts n’est sous le seuil de mise en garde.
Choisissez la plus petite pipette dont la plage couvre le volume. Selon le résumé qu’en fait Rainin, la norme ISO 8655 considère 10 % du volume nominal d’une pipette variable comme son volume minimal utile.
La technique compte autant que l’instrument. Dans la liste des erreurs d’opérateur courantes de Rainin, réutiliser un embout peut coûter jusqu’à 4 %, laisser du liquide sur l’embout au lieu de toucher la paroi du récipient avec celui-ci jusqu’à 3 %, et omettre le prémouillage jusqu’à 2 %. Les liquides visqueux ou denses, comme une solution mère dans le DMSO, se transfèrent de façon plus fiable avec une pipette à déplacement positif.
- 0,1 µL
- ±48 % systématique, ±12 % aléatoire (pipette de 0,1 à 2,5 µL)
- 0,25 µL
- ±12 % systématique, ±6,0 % aléatoire (pipette de 0,1 à 2,5 µL)
- 1 µL
- ±2,5 % systématique, ±1,8 % aléatoire (pipette de 0,5 à 10 µL)
- 2 µL
- ±5,0 % systématique, ±1,5 % aléatoire (pipette de 2 à 20 µL)
- 10 µL
- ±1,2 % systématique, ±0,6 % aléatoire (pipette de 2 à 20 µL)
- 1 000 µL
- ±0,6 % systématique, ±0,2 % aléatoire (pipette de 100 à 1 000 µL)
Limites d’erreur tirées du manuel d’utilisation de l’Eppendorf Research plus (§ 11.3), pour les modèles monocanal à volume variable utilisés avec des embouts Eppendorf. Les deux seuils du calculateur sont fixés à partir de ces valeurs.
Quel volume le peptide dissous ajoute-t-il?
Environ 7 µL pour 10 mg : assez pour compter seulement dans les solutions concentrées.
Les molécules dissoutes occupent un volume propre. Pour les protéines, le volume spécifique partiel va de 0,70 à 0,76 mL/g, et 0,73 mL/g est la moyenne habituelle. Les petites protéines sont plus denses que les grandes, et prolonger une courbe de densité publiée jusqu’à un peptide d’environ 1,4 kDa donne environ 0,67 mL/g. Cette valeur se situe sous les données mesurées : tous les chiffres de déplacement présentés ici sont donc approximatifs.
À 0,73 mL/g, 10 mg de peptide ajoutent environ 7,3 µL; à 0,67 mL/g, environ 6,7 µL. Lorsqu’on ajoute un volume mesuré de solvant à la poudre dans un flacon, le volume final correspond au solvant plus ce surplus, et la concentration réelle est légèrement inférieure à quantité ÷ volume de solvant.
Le calculateur affiche le déplacement approximatif à 0,73 mL/g et le signale lorsqu’il dépasse 1 % du volume de solvant, ce qui ne se produit qu’au-dessus d’environ 13,7 mg/mL.
Aucune correction ne s’applique à une fiole jaugée remplie jusqu’au trait : son volume final est déjà exact, quel que soit le volume qu’occupe le peptide.
La solution tiendra-t-elle dans le contenant?
Le calculateur compare chaque volume calculé au contenant choisi, et il traite différemment les flacons et les fioles jaugées.
Laisser de l’espace au-dessus du liquide
Un flacon ou un microtube a besoin d’un espace de tête. Le calculateur émet une mise en garde lorsque le liquide occuperait plus de 90 % de la capacité indiquée et signale une erreur au-delà de 100 %. Les préréglages couvrent un tube de 1,5 mL, un flacon HPLC de 2 mL et des flacons de 3, 5 et 10 mL, et toute autre capacité peut être saisie.
Remplie jusqu’au trait, par conception
Une fiole jaugée est faite pour être remplie exactement jusqu’à son trait de jauge, avec un espace de tête dans le col au-dessus. Le calculateur accepte une fiole jaugée de 10 mL à son volume nominal et ne signale une erreur qu’au-delà.
Changer de contenant ou de concentration visée
Le peptide A, dont le contenu mesuré est de 10,00 mg et la masse moléculaire de 1 250,0 g/mol, exige 8,000 mL pour atteindre 1,000 mM. C’est plus que ne contient un flacon de 3 mL : le calculateur signale donc une erreur de capacité. Préparez la solution dans une fiole jaugée, dont le volume fixe alors la concentration, ou choisissez une concentration de solution mère plus élevée qui tient dans le flacon, puis diluez-la pour la méthode.
Un nombre de volumes, pour limiter la congélation-décongélation
Les aliquotes servent à éviter de congeler et de décongeler une solution mère à répétition. Le mode Aliquotes divise un volume de solution mère par un volume d’aliquote en µL et indique le nombre et le reste, jamais une quantité de peptide par aliquote. Ce nombre est un maximum, car on ne peut pas récupérer chaque microlitre d’un contenant. Le calculateur accepte des aliquotes de 10 µL ou plus; le minimum d’un fabricant pour un mélange de peptides est de 20 µL. Le guide sur la conservation traite de la taille des aliquotes et du choix des tubes.
Quelle est l’exactitude d’une concentration calculée?
Celle de ses données. Le calcul est exact; la solution ne vaut que ce que valent la quantité, la pipette et le contenant.
Le calculateur affiche quatre chiffres significatifs et n’arrondit jamais en cours de calcul. Cette précision appartient au calcul, pas à la solution. Le déplacement de volume peut à lui seul modifier une concentration de quelques dixièmes de pour cent, un petit transfert peut comporter une erreur systématique de 1 à 5 %, et les mesures de teneur nette de deux laboratoires sur les mêmes peptides ont différé de jusqu’à 12,5 %.
Une concentration calculée est une valeur prévue. Lorsqu’une méthode exige la concentration mesurée, l’analyse des acides aminés est la méthode de référence, et l’absorbance UV avec un coefficient prédéfini peut convenir pour des peptides bien caractérisés (Hoofnagle et coll., 2016).
Consignez ce sur quoi repose la valeur : la base de la quantité, la masse moléculaire, le solvant, les volumes et le contenant. La fiche de préparation du calculateur reprend la base, le solvant, le volume et les concentrations, avec la date et un espace pour les initiales, prête à copier ou à imprimer. La plupart des exercices du guide de travaux pratiques HPLC partent d’une seule solution préparée.
- Champs de l’étiquette viergeContenu; concentration; solvant final; lot d’origine; date; initiales; date de réanalyse ou de rejet.
Exemples de calcul en laboratoire
| # | Formule | Valeur |
|---|---|---|
| E1 | 10 mg ÷ 2 mL | 5,000 mg/mL · 5 000 µg/mL |
| E2 | 5 mg/mL; 1250 g/mol | 4 000 µM · 4,000 mM |
| E3 | Peptide A: 10 mg; 1 mM; 1250 g/mol | 8,000 mL · Le volume de liquide dépasse la capacité du contenant. |
| E4 | 10 mg × 80% × 98% | 7,840 mg |
| E5 | 5 mg/mL → 100 µg/mL; 1 mL | Transfert: 20,00 µL + Diluant: 980,0 µL |
| E6 | 1:10 × 4; 1 mL | Transfert: 100,0 µL + Diluant: 900,0 µL; 100,0 → 10,00 → 1,000 → 0,1000 µg/mL; Après le transfert suivant, les tubes 1 à 3 contiennent 900 µL. |
| E7 | 1,5 mL ÷ 50 µL | Aliquotes: 30, reste 0 µL |
| E8 | 5 mg/mL → 1 µg/mL; 1 mL | 0,2000 µL · Transfert inférieur à 2 µL. Préparez une dilution intermédiaire de 1:100. |
Questions fréquentes sur les calculs de solutions en laboratoire.
Comment calcule-t-on la concentration d’une solution mère après la reconstitution?
Divisez la quantité de peptide par le volume final de solution. Des milligrammes divisés par des millilitres donnent des mg/mL; multipliez par 1 000 pour obtenir des µg/mL. Utilisez une quantité sur une base déclarée, comme un contenu mesuré, et le volume final, qui dans un flacon correspond au solvant plus le petit volume qu’ajoute le peptide dissous, environ 7 µL pour 10 mg.
Quel volume de solvant donne une solution mère à 1 mg/mL ou à 1 mM?
Divisez la quantité par la concentration visée : V = m ÷ c pour une concentration massique, ou V = m ÷ (c × masse moléculaire) pour une concentration molaire. Le peptide A, dont le contenu mesuré est de 10,00 mg et la masse moléculaire de 1 250,0 g/mol, exige 8,000 mL pour 1,000 mM. Partez d’une quantité que vous pouvez justifier, un contenu mesuré ou masse brute × teneur nette × pureté, et non de la valeur de l’étiquette. Si le volume dépasse le contenant, préparez la solution dans une fiole jaugée, ou préparez une solution mère plus concentrée et diluez-la pour la méthode.
Comment convertir des mg/mL en µM?
Divisez la concentration massique par la masse moléculaire en g/mol, puis multipliez par 1 000 000. Cela fonctionne parce que 1 mg/mL équivaut à 1 g/L, et que des grammes par litre divisés par des grammes par mole donnent des moles par litre. À 1 250,0 g/mol, 5,000 mg/mL correspondent à 4,000 mM, soit 4 000 µM. Une concentration massique n’exige aucune masse moléculaire; les formes molaires, oui, et la masse moléculaire doit correspondre à la base de la masse.
Quelle masse moléculaire saisir : peptide libre, sel ou lot?
Celle qui correspond à la base de la masse. Associez la masse moléculaire du peptide libre, calculée à partir de la séquence, à une masse nette de peptide ou à un contenu mesuré, car la teneur nette exclut déjà les contre-ions et l’eau. Une masse moléculaire du sel ou propre au lot ne va qu’avec la masse brute de poudre, et seulement si elle reflète les contre-ions et l’eau réellement présents. Mélanger les bases compte les contre-ions deux fois ou les omet : pour un peptide de 1 200 g/mol portant deux contre-ions TFA, l’erreur est d’environ 19 %.
Faut-il corriger selon la pureté HPLC ou selon la teneur nette en peptide?
Selon les deux, en les multipliant. La pureté HPLC est la part de l’aire des pics du chromatogramme, lue vers 214 à 220 nm, qui revient au peptide visé; elle ne voit ni les contre-ions ni l’eau. La teneur nette en peptide est la part de la poudre pesée qui est du peptide, quel qu’il soit, et elle compte aussi les impuretés peptidiques. Masse brute × teneur nette × pureté HPLC (aire des pics) estime le peptide visé : 10,00 mg à 80,0 % et 98,0 % donnent 7,840 mg.
Faut-il peser une portion de moins d’un milligramme ou dissoudre tout le contenu?
Une pesée de moins d’un milligramme exige une microbalance. Selon le résumé que fait METTLER TOLEDO du chapitre USP 〈41〉, la plus petite masse nette qu’une balance pèse de façon fiable à 0,10 % correspond à environ 820 échelons : 8,2 mg sur une balance d’échelon 0,01 mg, 82 mg sur une balance d’échelon 0,1 mg et, selon la même règle, 0,82 mg sur une microbalance d’échelon 0,001 mg. Une poudre hygroscopique prend aussi de l’eau pendant qu’elle repose sur le plateau. Dissoudre tout le contenu évite l’erreur de pesée, mais suppose de tout récupérer et de disposer d’un contenu mesuré pour ce contenant. Hoofnagle et coll. proposent d’abord un essai de solubilité sur une petite portion pesée, et de garder la poudre sèche en portions de 0,1 à 1 mg.
Comment mesurer la concentration quand une séquence ne contient ni tryptophane ni tyrosine?
L’absorbance à 280 nm provient du tryptophane, de la tyrosine et de la cystine : une séquence sans tryptophane ni tyrosine absorbe peu à cette longueur d’onde, et les prédictions sont moins fiables sans tryptophane. Des coefficients calculés à partir de la séquence existent à 205 nm (Anthis et Clore, 2013) et à 214 nm (Kuipers et Gruppen, 2007), où la liaison peptidique elle-même absorbe. Mesurez contre un blanc du même solvant. L’analyse des acides aminés demeure la méthode de référence.